阿尔茨海默病（AD）为临床常见的慢性神经系统退行性疾病,包含了精神行为、社会功能和认知功能等多方面的障碍或者异常,同时患者病程表征为进行性发展,具有不可逆性。关于全球范围内AD的2015年报道显示,全世界范围内每3秒就可能出现1例临床新发的患者,而到2050年全世界AD患者可能会升高至1.315亿人左右,同时这其中约70%患者来自发展中国家。临床AD患者人数的不断的增加和发病率的日益升高对世界各国的经济与社会带来了巨大的负担和沉重的压力,在2015年全世界关于AD患者的护理与照料等成本在8200亿美元左右,而发展到2030年该成本可增大到约2万亿美元。同时上述报道还指出全世界范围内AD患者最多的区域为东亚,我国是东亚中人口最多、地理面积最大的国家,特别是近年来,伴随国内老龄化人口的持续增加,AD对我国社会经济、地区与患者家庭均带来了巨大的挑战与负担。近年的研究显示,AD发病机制和微小RNA（miRNA）联系紧密,在机体内正常神经系统中miRNA参加调控了诱导神经干细胞分化、神经系统发育、神经保护、神经元增殖与凋亡、产生树突棘、突触可塑性等不同的信号传导通路、不同生理过程。因此本研究通过分析miR-let-7f在AD患者中的表达以及对SHSY-5Y细胞氧化损伤作用机制,以期为临床患者的诊疗提供更多的实验室依据和理论支撑。本研究将从3个方面开展研究,第一部分研究AD患者血清氧化应激指标表达及与认知功能障碍的相关性,明确AD患者血清氧化应激相关指标（如Mn SOD、GSH-Px、CAT、SOD等）的异常表达。第二部分为分析miR-let-7f在AD患者中的表达及临床意义,以明确miR-let-7f在AD患者中的可能作用。第三部分通过阐明miR-let-7f在SHSY-5Y细胞氧化损伤中的潜在作用,有望进一步明确miR-let-7f在AD发病机理中的分子机制。第一部分阿尔茨海默病患者血清氧化应激指标表达及与认知功能障碍相关性目的:分析AD患者血清氧化应激指标表达及与认知功能障碍相关性情况。方法:回顾性分析于沧州市中心医院治疗AD患者30例作为AD组,选取同期在本院体检的健康者30例作为对照组。记录患者临床资料情况,包含姓名、婚姻史、性别、家族史、年龄、联系电话、体重、身高和生命体征等。记录患者血清氧化指标（Mn SOD、GSH-Px、CAT、SOD、MDA、Hcy）水平和CDR、MMSE评分情况。对AD患者血清氧化指标和CDR、MMSE评分行相关分析。结果:1.AD组患者年龄在58至69岁之间,平均（63.18±10.17）岁,男性16例、女性14例,BMI指数在21.9至26.8 kg/m2之间,平均（25.58±3.20）kg/m2,受教育时间4至16年,平均（11.01±6.14）年,12例有吸烟史,12例有饮酒史,合并症方面:8例有心脏疾病、15例有高脂血症、10例有糖尿病。对照组患者年龄在55至70岁间,平均（66.94±10.84）岁,男性15例、女性15例,BMI指数在21.4至26.9 kg/m2间,平均（24.64±4.10）kg/m2,受教育时间4至15年,平均（9.27±5.10）,13例有吸烟史,14例有饮酒史,合并症方面:9例有心脏疾病、14例有高脂血症、9例有糖尿病,两组患者年龄、性别、合并症、吸烟与饮酒史、受教育时间和BMI指数等对差异无统计学意义（P>0.05）。2.AD组患者血清Mn SOD、GSH-Px、CAT、SOD含量分别为（7.65±1.36）ng/ml、（152.66±40.13）μmol/L、（18.32±2.17）U/ml、（62.01±4.99）U/ml,低于对照组的（12.49±2.18）ng/ml、（199.74±41.82）μmol/L、（18.32±2.17）U/ml、（69.17±4.31）U/ml,AD组患者血清MDA、Hcy含量分别为（6.41±1.60）μmol/L、（29.10±6.47）μmol/L,高于对照组的（4.69±1.74）μmol/L、（23.70±7.52）μmol/L;AD组患者CDR评分为（2.61±0.35）分,高于对照组的0分,MMSE评分为（22.57±3.18）分,低于对照组（27.79±3.15）分,差异均有统计学意义（P<0.05）。3.AD患者血清Hcy、MDA含量和CDR评分为正相关（P<0.05）,AD患者血清Mn SOD、GSH-Px、CAT及SOD含量和CDR评分为负相关（P<0.05）。AD患者血清Hcy、MDA含量和MMSE评分为负相关（P<0.05）,AD患者血清Mn SOD、GSH-Px、CAT及SOD含量和MMSE评分为正相关（P<0.05）。小结:1.相比健康者AD患者血清氧化应激指标出现显著异常;2.AD患者认知功能障碍和血清氧化应激指标存在明显的相关性;3.AD患者机体内氧化平衡损伤可能为导致认知降低的因素。第二部分miR-let-7f在阿尔茨海默病患者的血清表达及临床意义目的:通过分析miR-let-7f在AD患者中的表达及临床意义,以明确miR-let-7f在AD患者中的可能作用。方法:回顾性分析于本院治疗AD患者30例作为AD组,选取同期在本院体检的健康者30例作为对照组。采集患者空腹静脉血5ml放置在无抗凝干燥试管中,离心机4000rmp离心10min,上清液分装在EP管内,保存于﹣80℃冰箱内保存。检测生化指标:血清脂联素（ANP）、总胆固醇（TG）、同型半胱氨酸（Hcy）、甘油三酯（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）采用全自动生化分析仪检测,各项指标的检测都依据仪器和试剂盒的说明书来进行,为了对检测质量进行控制,本研究的全部样品都由检验科的人员在同一台仪器上进行检测,每个样本都重复检测3次。miRNA微阵列分析AD患者中各种miRNA表达水平情况;记录AD组和对照组血清miR-let-7f表达情况;记录AD组和对照组血清ANP、Hcy、TC、TG、HDL-C、LDL-C含量和MMSE评分情况;记录AD患者血清miR-let-7f表达与血清ANP、Hcy、TC、TG、HDL-C、LDL-C含量及MMSE评分相关性情况;对影响AD发病因素的二分类Logistic回归分析。结果:1.和对照组相比,AD患者内出现差异表达的miRNA共11种,其中有6个miRNA,即miR-242、miR-301、miR-134、miR-let-7i、miR-let-7f和miR-34a表达显著升高,而有5个miRNA,即miR-18a、miR-188、miR-214、miR-328和miR-3135a表达显著降低。2.AD组患者血清miR-let-7f表达为（1.84±0.32）,高于对照组的（1.02±0.14）,差异有统计学意义（P<0.05）。3.AD组患者TC、TG和HDL-C含量分别为（1.71±0.84）mmol/L、（21.63±1.77）mmol/L、（1.31±0.40）mmol/L,和对照组的（1.79±0.95）mmol/L、（22.04±1.81）mmol/L、（1.34±0.39）mmol/L对比差异无统计学意义（P>0.05）。AD组患者血清ANP含量、MMSE评分分别为（6.80±2.81）μg/ml、（22.57±3.18）分,低于对照组的（11.91±3.06）μg/ml、（27.79±3.15）分,AD组患者血清Hcy、LDL-C含量分别为（29.10±6.47）μmol/L、（2.85±0.68）mmol/L,高于对照组的（23.70±7.52）μmol/L、（2.37±0.54）mmol/L,差异有统计学意义（P<0.05）。4.AD患者血清miR-let-7f表达和HDL-C、TG与TC含量无相关性（P>0.05）。AD患者血清miR-let-7f表达和MMSE评分、ANP含量为负相关（P<0.05）,和Hcy含量、LDL-C含量为正相关（P<0.05）。小结:miR-let-7f在AD患者血清内高表达,可能参与了患者的发病与病情进展。第三部分miR-let-7f对SHSY-5Y细胞氧化损伤的作用机制研究目的:阐明miR-let-7f在SHSY-5Y细胞氧化损伤中的潜在作用,有望进一步明确miR-let-7f在AD发病机理中的分子机制。方法:培养SHSY-5Y细胞,制备H2O2损伤诱导氧化应激损伤模型,MTT检测细胞活力,流式细胞分析仪检测细胞凋亡情况,miR-let-7f模拟物、miR-let-7f-1抑制剂转染SHSY-5Y细胞,使用q RT-PCR和Western blot进行测量miR-let-7f、AKT-2和凋亡相关蛋白,萤光素酶报告基因检测miR-let-7f和AKT-2的靶向关系。结果:采用0、50、100、200、500μmol/L的H2O2引起SHSY-5Y氧化损伤,结果显示和未处理细胞相比,各剂量组的细胞活力均显著降低（P<0.05）,另外选取200μmol/L的H2O2用于后续实验。流式细胞仪对细胞凋亡检测显示,和对照组相比,应用200μmol/L的H2O2处理的SHSY-5Y细胞凋亡率显著升高（P<0.05）。和对照组相比,H2O2处理组Bcl-2蛋白表达降低,Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达升高（P<0.05）。采用miR-let-7f mimic、miR-let-7f inhibitor以及mimic NC、inhibitor NC分别转染SHSY-5Y细胞,q RT-PCR检测显示,相比mimic NC,miR-let-7f mimic组miR-let-7f表达显著升高;相比inhibitor NC,miR-let-7f inhibitor组miR-let-7f表达显著降低（P<0.05）。相比对照组,H2O2处理组细胞活力显著降低,而细胞凋亡率显著升高（P<0.05）;相比mimic NC,miR-let-7f mimic组细胞活力显著升高,而细胞凋亡率显著下降（P<0.05）;相比inhibitor NC,miR-let-7f inhibitor组细胞活力显著降低,而细胞凋亡率显著升高（P<0.05）。在明确miRNA-let-7f为潜在分子改善H2O2导致氧化损伤后,进行广泛生物学信息分析,以确定miRNA-let-7f的靶向基因。通过搜索各种数据库（micro RNA.org和Target Scan）显示,ALT-23’-UTR具有对应的配对和miR-let-7f结合应用,见图9。萤光素酶报告基因测定来检测miR-let-7f和AKT-2的关系,共转染的SHSY-5Y细胞的相对荧光素酶活性明显降低应用miR-let-7f和AKT-2的3’-UTR（P<0.05）。小结:miR-let-7f的上调减轻了H2O2诱发的通过靶向AKT-2对SHSY-5Y细胞的氧化损伤。这些发现为miR-let-7f在AD患者氧化损伤的发病机理中的作用提供了新的视角。