背景结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,好发于直肠与乙状结肠交界处。据统计,目前结直肠癌发病率位于胃肠道肿瘤的发病率的第3位。迄今为止,结直肠癌临床治疗主要以手术切除为主,术后辅以有目的的放疗和化疗,结肠癌术后5年生存率为74%,手术根治率为85%。尽管如此,癌症仍然为无法根治之症,化学药物治疗对患者身心造成极大的损害与折磨,因此,探寻一类高效、低毒副作用生物治疗药物,成为世界范围内治疗恶性肿瘤的热议话题。在恶性肿瘤的临床治疗和基础研究中崭露头角的蛋白质组学,已延伸至肿瘤研究的前沿领域及热议技术之一。近年来,随着多肽抗肿瘤模型逐渐完备,体外表达系统的研究也更为明确,寻找肿瘤患者和健康患者之间差异多肽,不仅有助于寻找潜在的恶性肿瘤标记物,并且还具有杀伤肿瘤细胞的作用,为寻找靶向杀伤药物提供依据。本实验组前期将肾母细胞瘤患儿血清与正常儿童血清对照组之间进行对比检测,筛选出两组中差异蛋白质——一段具有功能的小分子肽段M/Z 6455.5Da。通过对血清标记物M/Z 6455.5Da蛋白多肽的研究,了解这类活性高、分子量小、毒副作用少的小分子多肽作用机制,找寻更有效的抗癌药物,为癌症晚期患者带来福音。目的利用CCK-8细胞凋亡技术、流式细胞分析技术、免疫荧光技术、Western-blot蛋白印迹技术,研究M/Z 6455.5Da肽段对两种结肠癌细胞的干预作用。材料与方法材料结肠癌细胞:COLO205、HCT116,购于中科院上海细胞库,M/Z 6455.5Da肽段来源于本课题组实验提纯。方法1、细胞毒性试验(CCK8法):利用不同浓度的M/Z 6455.5Da蛋白分别干预结肠癌COLO205细胞、HCT116细胞,用细胞增殖毒性试验(Cell Counting Kit-8简称CCK-8法),分别孵育24h、48h、72h后,观察M/Z 6455.5Da对结肠癌COLO205细胞、HCT116细胞的抑制作用,并且作图描绘细胞生长曲线。2、流式细胞技术:利用不同浓度的M/Z 6455.5Da蛋白干预结肠癌COLO205细胞、HCT116细胞,并了解其对于细胞凋亡的影响。3、间接免疫荧光试验:使用不同浓度的带有异硫氰酸荧光素标记的M/Z 6455.5Da蛋白分别干预结肠癌COLO205细胞、HCT116细胞,通过细胞间接免疫荧光技术,显示细胞状态的改变。4、Western-blot蛋白印记技术:将不同浓度的M/Z 6455.5Da蛋白干预结肠癌COLO205细胞、HCT116细胞后,通过蛋白质印记技术,分析与凋亡有关的蛋白如Bax、Bcl-2的变化。结果1、细胞毒性试验结果:在分别为0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml五种浓度的血清标记物M/Z 6455.5Da作用下,对COLO205细胞、HCT116细胞的增殖均有不同程度的抑制作用,且其各浓度对应的细胞抑制率之间的差异具有统计学意义(P<0.05),故推测其细胞抑制率呈时间-依赖性。2、流氏细胞技术检测细胞凋亡结果分析:对照组、浓度为0.75mg/ml及1.25mg/ml血清标记物M/Z 6455.5Da多肽处理后的结肠癌COLO205细胞凋亡率分别为2.06%±0.32%、12.25%±0.43%、30.05%±0.79%,凋亡率差异有统计学意义(P<0.05)。对照组、浓度为0.75mg/ml及1.25mg/ml M/Z 6455.5Da多肽处理后的结肠癌HCT116细胞凋亡率分别为3.75%±0.41%、17.45%±0.82%、33.15%±0.78%,凋亡率差异有统计学意义(P<0.05),故可推测血清标记物M/Z 6455.5Da蛋白多肽能诱导此两种结肠癌细胞发生凋亡。3、细胞间接免疫荧光结果:浓度分别为1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml的M/Z 6455.5Da蛋白多肽分别处理结肠癌COLO205细胞、HCT116细胞后,通过Image-Pro Plus6.0显微图像分析系统测算平均光密度(AOD)。随着多肽浓度的增加,AOD值随之增加,差异具有统计学意义(p<0.05),提示随着多肽浓度的增加,进入细胞内多肽的含量越多。4、Western-blot蛋白印迹试验结果:M/Z 6455.5Da蛋白多肽能通过上调促凋亡蛋白BAX、下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量抑制细胞增殖(P<0.05)。结论血清标记物M/Z 6455.5Da蛋白质多肽对体外培养的结肠癌细胞COLO205与HCT116有增殖抑制作用,并且呈现时间-浓度依赖效应;通过直接进入细胞内发挥细胞毒性作用,并呈现浓度依赖性;能通过上调促凋亡蛋白BAX、下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量抑制细胞增殖。