桃豫农矮砧1号离体快繁体系的研究和SSR-PCR反应体系的优化

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本试验于2008-2011年在河南农业大学进行,以桃豫农矮砧1号当年生枝条茎段和叶片为外植体,对茎段腋芽诱导培养基的筛选、叶片外植体灭菌剂的筛选、愈伤组织的诱导及继代培养、DNA的提取以及SSR-PCR反应体系的优化进行了初步的研究。研究结果如下:1.茎段腋芽诱导培养基的筛选。将灭菌的带芽茎段接种于不同的初代培养基中,结果表明:适合茎段腋芽诱导培养基为附加1.4 mg/L BA和0.3 mg/L IBA的MS培养基。2.叶片无菌体系的建立。采用不同灭菌剂对桃豫农矮砧1号叶片进行灭菌,结果表明:用消毒片(有效氯50mg/g)灭菌效果明显优于NaClO(次氯酸钠) HgCl2(升汞);不同浓度的消毒片灭菌处理以5.0 g/L消毒片灭菌8min效果最好。3.叶片愈伤组织的诱导。以桃豫农矮化砧木1号的叶片为试验材料,研究2,4-D浓度、光照条件对愈伤组织诱导的影响。结果表明:2,4-D的浓度在02.0 mg/L范围内,随着其浓度的增加,愈伤组织的诱导率也随之增加;当2,4-D的浓度为2.0mg/L时,愈伤组织的诱导率达到最大值,为83.3%;当2,4-D浓度超过2.0 mg/L,愈伤组织的诱导率就会下降。以附加2.0 mg/L 2,4-D的MS培养基在黑暗条件下培养,愈伤组织诱导率最高。4.愈伤组织继代培养。比较不同培养基及不同继代周期对其生长的影响,结果表明,分别采用附加1.0 mg/L 2.4-D的MS和WPM培养基进行交替继代培养,可以实现桃YN2和YN3类型愈伤组织的长期继代保持,并使其保持旺盛生长。5.幼叶基因组DNA的提取。以桃豫农矮砧1号幼叶为试验材料,通过紫外检测、电泳检测和酶切分析,对常规CTAB法、改进CTAB法、常规SDS法和SDS-CTAB结合法的DNA提取效果进行了比较研究。结果表明:常规SDS法和SDS-CTAB结合法适合桃豫农矮砧1号幼叶DNA的提取,其提取的DNA蛋白质、糖类和酚类等杂质和盐份去除干净,浓度较高,电泳检测DNA条带的清晰度和亮度明显高于其他两种方法,且能被限制性内切酶完全消化。6、SSR-PCR反应体系的优化。通过对影响SSR反应的6个要素设计正交试验,确定了最优的SSR-PCR反应体系,即20μl反应体系:25 mmol/L Mg2+ 2.0μl,2.0 mmol/L dNTPs 1.2μl,10×Buffer 3.0μl,5U的Taq酶0.2μl,50 ng/μl DNA 0.6μl,10μmol/L的左右引物各1.5μl。
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