猪嵴病毒（Porcine Kobuvirus,PKV）是一种常见的猪肠道病毒,呈区域流行性且不受地区的限制,在流行地猪群均可检测出该病毒,健康猪和腹泻猪中均可检出。目前PKV的研究主要集中在流行病学调查、检测技术等方面,关于PKV感染仔猪后的组织学分布、及感染后宿主的免疫应答机制报道较少。为了研究猪嵴病毒在感染宿主后的组织学定位,以及相关的免疫应答机制,本研究采集了无腹泻症状健康仔猪肠道组织样品,采用RT-PCR方法对几种常见的猪腹泻病毒进行检测。选择3头PKV单独感染仔猪以及3头无常见腹泻病毒感染仔猪的组织样品,以研究病毒的定位以及对小肠黏膜形态的影响。同时对病毒进行分离,并且以猪回肠上皮细胞系（IPI-2I）为研究模型,探讨PKV感染对肠道先天免疫应答机制的影响。主要研究内容如下:1.猪嵴病毒的分离鉴定以及全基因组测序分析采集到十二头无腹泻症状健康仔猪（＜4周）肠道组织样品,以及淋巴器官组织样品,分别置于多聚甲醛和-80℃保存。经RT-PCR检测后挑选单独感染PKV的仔猪肠道组织样品,取组织研磨液上清孵育猪肾细胞系（PK-15）细胞对病毒进行分离。结果显示:盲传2代后出现细胞病变,随后在猪回肠上皮细胞系（IPI-2I）上进行传代,发现该病毒同样可以在IPI-2I细胞上产生明显细胞病变。之后通过RTPCR的方法对病毒进行鉴定,确定分离所得到的病毒为PKV。并且利用地高辛标记法制备DNA核酸探针,大小为194bp,可用于PKV的检测和组织学定位。随后对所分离得到的PKV毒株进行全基因组测序,命名为Wuhan2020株,测序结果上传Gen Bank,登录号为:OK315318。本次实验分离得的PKV毒株全基因组序列共有8145个碱基。由20.32%A,31.43%G,20.76%G,27.49%T核苷酸组成。5′UTR长512nt,3′UTR长169nt,中间是单个7464nt的开放阅读框,编码2488个氨基酸,没有poly A尾。与Gen Bank中上传的15株PKV的全基因组序列进行比对。核苷酸同源性在87.1%-90.9%不等,与WUH1株处于同一进化分支。2.猪嵴病毒感染仔猪后肠道组织学定位及其对肠黏膜形态的影响制作HE切片观察组织病理学变化,并且通过原位杂交方法对PKV进行定位。HE结果显示:与正常仔猪相比,PKV感染仔猪的十二指肠整体结构完整,绒毛少量断裂脱落,部分绒毛固有层中有浆液性渗出,空肠结构完整,回肠PP结中淋巴细胞数量减少,肠道形态结构完整,与正常仔猪无明显差别。原位杂交结果显示:阳性信号分布于肠绒毛上皮细胞和固有层淋巴细胞中。3.猪嵴病毒感染对肠道免疫细胞的影响以自然感染PKV的仔猪肠道组织作为材料制作石蜡组织切片,通过免疫组织化学、PAS染色、甲苯胺蓝的方法对肠道免疫细胞进行染色及定位。对各肠段免疫组化阳性率以及有关免疫细胞数量进行统计分析。统计结果显示:与正常仔猪相比,PKV自然感染仔猪小肠中肥大细胞数量增多（P＜0.05）,回肠中杯状细胞数量增多（P＜0.05）,十二指肠中CD3+、CD4+T淋巴细胞细胞数量减少（P＜0.05）,空肠和回肠中CD3+、CD4+T淋巴细胞细胞数量减少（P＜0.001）,CD8+T淋巴细胞、B淋巴细胞数量在各肠段均无显著性变化。对淋巴器官中的淋巴细胞数量进行统计,PKV自然感染仔猪与正常仔猪均无显著差异。4.猪嵴病毒感染对肠道先天免疫应答的影响以IPI-2I细胞系为研究对象,PKV感染IPI-2I细胞后,q PCR检测模式识别受体（PRRs）通路相关基因的转录水平,结果显示:感染后随着时间的推移,相关基因的转录水平均有不同程度的上调,其中RIG-1、MAVS、MDA5、MX2差异显著（P＜0.05）,TLR3、NF-κB、NOD2、My D88、IRF3等差异极显著（P＜0.01）,TLR4无显著差异。同时分析不同剂量PKV感染12h时IPI-2I中PRRs通路相关基因的转录水平,结果显示:随着感染剂量的增加,相同时间点基因的转录水平也随之提高。其中MAVS、My D88差异极显著（P＜0.01）,RIG-I、TLR4、NF-κB、IFN-α、MX1差异显著（P＜0.05）。说明PKV对PRRs通路的激活水平与感染剂量呈正相关。之后对相关基因表达TLR3、TLR4、IFN-G进行Western-blot检测,结果与q PCR相符。以上研究结果表明,PKV可在PK-15、IPI-2I细胞中增殖。各个毒株之间的变异度较大,推测环境及地区因素可能在病毒进化过程中有着重要的作用。PKV感染仔猪后定位于小肠绒毛上皮细胞中以及固有层淋巴细胞中,对仔猪小肠黏膜形态损伤较小,抑制一部分肠道的细胞免疫功能。PKV感染后,宿主激活PRRs信号通路,诱导局部黏膜免疫应答。