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杂合抗菌肽是通过基因工程手段,将两种或多种不同的抗菌肽片段连接起来,从而形成新型的更具有活性的抗菌肽。是在天然抗菌肽的基础上,通过改变抗菌肽内部的构效关系和理化性质,尽量减少天然抗菌肽所具备的各项缺点,最终增加母抗菌肽的抑菌活性。本试验根据抗菌肽LfcinB和Apidaecin的氨基酸序列结构,通过生物信息软件模拟杂合抗菌肽Lf-Ap的结构,根据毕赤酵母密码子偏爱性,通过软件primer premier 5.0完成试验中的引物设计,优化设计杂合抗菌肽Lf-Ap基因序列,采用PCR技术成功扩增出约为98bp的新型杂合抗菌肽Lf-Ap基因并完成载体构建,经质粒大小、重组质粒双酶切、PCR扩增鉴定及DNA测序验证,证明已将目的基因成功克隆到表达载体上,构建出重组质粒pPICZαA-Lf-Ap。构建成功的重组质粒经线性化后电转整合至毕赤酵母GS115宿主菌中,用含有Zeocin的选择性培养基筛选高拷贝转化菌株。利用试剂盒提取阳性菌株的基因组,采用PCR扩增的方法验证重组质粒pPICZαA-Lf-Ap已整合至酵母基因组中。将筛选后的GS115-pPICZαA-Lf-Ap在BMMY培养基中完成甲醇诱导表达,表达后的产物通过SDS-PAGE电泳进行检测,经电泳结果分析可知,表达产物在3.6kD处有明显条带,与预期大小相符。采用琼脂扩散法检测杂合抗菌肽的表达产物对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母和黑曲霉等的抑菌效果。结果表明,杂合抗菌肽Lf-Ap对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌产生的抑菌直径分别为19mm、22mm、24mm,但对啤酒酵母、黑曲霉等真菌无明显抑菌效果。且抑菌效果与杂合前的抗菌肽LfcinB和Apidaecin相比,其抑菌活性明显增强,抗菌谱也更广。遗传稳定性较好,宿主菌在培养传代50次后,经PCR验证目的基因尚未丢失,表达产物仍具有抑菌效果。综上所述,本研究成功地克隆了杂合抗菌肽Lf-Ap基因,并在真核表达体系中进行了表达。利用甲醇对真核菌株毕赤酵母在适宜的条件下进行诱导表达,表达后的蛋白产物具有较强的抑菌活性。