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丹参(iSalvia miltiorrhiza Bunge)为唇形科多年生药用草本植物,以干燥根和根茎入药,主要活性成分为脂溶性的丹参酮类化合物和水溶性的酚酸类化合物。虽然酚酸类物质生物合成途径上的大多数关键酶基因已经被鉴定,但由迷迭香酸(RA)生成丹酚酸B(SalB)的途径依然未知,目前推测漆酶(Laccase)可能催化RA发生聚合形成SalB。漆酶(EC1.10.3.2)是多铜氧化酶中的一种含铜的糖蛋白氧化酶,在植物中主要参与木质素合成、伤口愈合、应激反应、以及维持细胞壁结构和完整性等过程。植物漆酶基因家族已在拟南芥、水稻、短柄草、杨树、高粱、棉花等多种物种中被鉴定。目前,丹参中漆酶基因的研究非常有限,其功能研究尚未见报道。基于此,本研究基于丹参全基因组序列的基础上,利用生物信息学手段对丹参漆酶基因家族成员进行鉴定和表达分析,筛选、克隆丹参中可能催化迷迭香酸发生聚合形成丹酚酸B的4个漆酶基因,并对其中的1个基因进行了功能研究。主要研究内容与结果如下:1.在丹参中鉴定出33个漆酶基因,系统进化树分析表明,这些基因成员可分成7个亚族,存在4对旁系同源基因和10个保守基序,其中第VII亚族的漆酶基因为丹参中特有的;适应性进化分析表明,在位点模型下,丹参漆酶基因家族主要经历了正选择作用;启动子分析表明,丹参漆酶基因的启动子区含有不同的激素响应元件和胁迫响应元件,其表达可能受不同激素及胁迫处理的诱导;基因表达模式分析发现,丹参漆酶基因家族成员在丹参的不同组织部位均有表达,其中有8个在根中特异性表达;分别对茉莉酸甲酯处理和水杨酸处理的转录组数据库进行比对分析,发现有8个基因对茉莉酸甲酯处理响应明显,有9个对水杨酸处理响应明显,而对这两种激素处理都响应明显的基因有4个(SmLAC14、SmLAC28、SmLAC30 和 SmLAC31)。2.利用PCR技术克隆得到了 4个可能催化丹参中RA发生聚合形成SalB的漆酶基因,分别是SmLAC2、SmLAC3、SmLAC20和SmLAC21,跨膜结构域和信号肽分析表明SmLAC2、SmLA C3和SmLAC20属于非跨膜的分泌型蛋白,而SmLAC21是跨膜的分泌型蛋白;利用酶切、酶连的方法将SmLAC2、SmLAC3、SmLAC20和SmLAC21的开放阅读框构建到原核表达载体pET28a上,加入IPTG(终浓度0.5 mM)于37℃诱导6 h后经SDS-PAGE电泳检测发现,目的蛋白主要以无活性的包涵体的形式表达,而诱导温度降低为30℃时,目的蛋白在上清中也有表达。3.利用Gateway技术构建了SmLAC3过表达载体,通过根瘤农杆菌介导的叶盘转化法将其成功转化丹参,得到20个DNA水平检测为阳性的转基因株系;经RNA水平检测,筛选出4个SmLAC3表达量较高的转基因株系(OE-2,OE-10,OE-15和OE-17)进行进一步的功能研究;利用HPLC法检测这4个SmLA C3过表达株系和2个对照株系(EV1和EV2)中迷迭香酸和丹酚酸B的含量,发现OE-2、OE-10、OE-15、OE-17转基因株系根中的迷迭香酸的含量相对于EV2株系分别提高了 2.44、2.93、3.48和2.62倍,丹酚酸B的含量相对于EV2株系分别提高了 1.82、2.79、3.42和2.13倍,,总酚酸含量相对于EV2株系分别提高了 1.57、2.01、2.51和1.73倍,总黄酮含量相对于EV2株系分别提高了 1.71、1.84、2.06和1.69倍;利用实时定量PCR技术检测转基因株系根中丹参酚酸合成途径的9个酶基因和木质素合成途径的2个酶基因的表达量,发现酚酸合成途径的9个酶基因都显著上调,其中SmTAT1在OE-2、OE-10、OE-15和OE-17转基因株系根中的表达量相对于EV2株系分别提高了 4.53、6.35、7.92和3.33倍,Sm4CL1分别提高了 4.81、6.12、6.40和5.41倍,Sm4CL2分别提高了 5.09、6.15、5.63和6.34倍,而木质素合成途径的2个酶基因的表达量也有显著提高;用番红染色法对各株系根中木质素进行染色,发现转基因株系中木质素的量较对照株系的有所减少。本研究的结果丰富了对丹参漆酶家族的认识,为解析丹酚酸B的生物合成途径奠定了基础。