研究背景与目的卵巢上皮性癌是严重危害妇女健康的一种妇科恶性肿瘤,其发病率居第二位,死亡率则位居第一。卵巢癌的临床特点是:卵巢癌早期无特殊症状,病情隐匿,不易被发现,70%-80%患者确诊时已属临床晚期（III或Ⅳ期）。原发病灶体积并不大时（临床早期）,即可发生盆腔和腹腔内广泛种植和播散转移,常伴发腹水。卵巢浆液性乳头状囊腺癌（浆乳癌）具有易复发和转移,尤其肝转移的特性,盆腹腔种植播散和腹膜后淋巴转移是浆乳癌的主要扩散途径,也是导致癌症患者治疗效果不佳和死亡的最重要、最常见的原因。因此,探讨卵巢浆乳癌侵袭与转移机制,寻找更有效的分子治疗靶标成为目前国内外分子肿瘤学研究热点。为提高卵巢癌分子靶向治疗的有效性,关键在于准确分析卵巢癌恶性表型基因并选择最佳候选药靶。迄今文献报道,参与卵巢癌复发和腹腔种植转移的效应分子包括生长因子（bFGF）、细胞因子（TNF-a,IL-8）,血管生成因子（VEGF）,细胞黏附因子（CD44H,E-cadherin,Integrin avb3和a5b1）、黏附分子受体LNR,细胞外基质蛋白水解酶类（如u-PA/u-PAR纤溶酶,基质金属蛋白酶（MMPs））、趋化因子配/受体（CXCLl2/CXCR4）和调控基因表达的转录因子p53等。近年已报道针对上述某些分子进行抗卵巢癌复发转移的实验研究,但总体疗效尚不令人满意。其原因可能为:1.在体外应用肿瘤细胞系确定恶性肿瘤复发转移的效应分子,并不能准确真实反映肿瘤在体内复杂微环境的实际情况;2.用传统的组织纯化方法获得研究材料,由于不能很好地解决细胞异质性问题,所获得的信息不能全面反映转移癌细胞与邻近细胞及其细胞外基质的相互作用;3.肿瘤转移为多基因参与,转移癌细胞自身遗传背景各异,所出现的转移过程亦非同步化完成。近年发展起来的广泛应用于基因组学和蛋白质组学的一种组织纯化技术-激光捕获显微切割技术（Laser Capture Microdissection,LCM）,可以在显微镜直视下原位快速、准确地获取所需的单一细胞亚群,甚至单个细胞,从而成功解决了组织中细胞异质性问题,可为生理和病理过程中发生的分子事件的精确研究提供真实反映在体实际情况的纯净目标细胞。目前,另一种新兴技术-基因芯片技术（cDNA Microarray）,能够让研究者同时分析成千上万个基因,甚至全基因组的表达情况,这种高通量的基因表达检测技术己被成功用于研究各种肿瘤的基因表达谱差异。所以本课题首先采用LCM技术从卵巢浆乳癌原发灶及其肝转移灶的冰冻组织切片中捕获均一同质性的肿瘤细胞,微量抽提的RNA经RNA线性扩增获得足量完整的RNA,有效偶联Agilent高通量含有1.9万基因的聚寡核苷酸表达谱芯片,筛选晚期原发卵巢浆乳癌组织与肝转移灶组织之间差异表达的功能基因群。最感兴趣的首次发现是:转移抑制因子CD9和囊泡运输重要的调节因子Rab25在肝转移灶中高度表达,故此我们选择了CD9和Rab25两个分子靶标,并对其在不同高低转移配对肿瘤细胞株和晚期卵巢浆乳癌转移配对临床新鲜标本中进行验证,初步评价CD9和Rab25的表达与肿瘤转移的相关性。鉴于确定卵巢癌抗侵袭转移最佳候选药靶的首要条件是分子靶标的有效性,因此本课题对CD9和Rab25两个分子靶标的功能进行深入研究。基于CD9和Rab25在卵巢癌转移病灶中存在表达异常和功能障碍,通过药物或者遗传修饰等手段控制CD9和Rab25的功能或它们的调节通路,将是一个令人振奋但又出人意料的分子治疗靶点。方法快速H&E染色法对冰冻切片肿瘤细胞的固定和染色;LCM技术从晚期浆液性卵巢癌原发灶及其肝转移灶的冰冻组织切片中捕获均一同质性的肿瘤细胞;微量RNA抽提法高质量提取捕获肿瘤细胞中总RNA;RNA体外线性扩增法体外扩增微量的RNA;与Agilent高通量含有1.9万基因的聚寡核苷酸表达谱芯片进行杂交及扫描,通过计算机应用Feature Extraction软件分析和处理数据;荧光实时定量PCR和RT-PCR检测10例浆液性卵巢癌配对转移的新鲜标本和4对配对高低转移肿瘤细胞系中CD9和Rab25 mRNA的表达水平;免疫组化EnvisionTM二步法及半定量分析方法检测晚期浆液性卵巢癌合并侞腔和腹腔不同部位转移以及脉管（包括血管和淋巴管）转移32例,正常卵巢组织14例中MRP-1/CD9和E-cadherin的表达,并进行相关临床病理因素分析;采用基因工程技术构建CD9和Rab25全长真核表达载体,G418筛选稳定表达CD9和Rab25的卵巢癌细胞克隆株;应用RT-PCR、cfse-流式细胞测定和体外细胞迁移实验等方法观察SKOV-3/CD9细胞P14K和AKT表达水平、细胞增殖及其运动能力的变化;应用RT-PCR、Western blot法检测A2780/Rab25细胞和A2780/Rab25B细胞中AKT、P-AKT、E-cadherin、β-catenin和Bcl-X/L的表达变化;采用MTT法、细胞迁移实验、Transwell体外侵袭实验和细胞黏附实验检测A2780/Rab25细胞和A2780/Rab25B细胞的增殖、细胞运动、体外侵袭和黏附能力;共聚焦显微镜成像观察Rab25和Rab25B的过度表达对A2780细胞骨架的影响;透射电镜观察A2780/Rab25细胞和A2780/Rab25B细胞的超微结构变化;卵巢癌裸鼠动物模型来观察Rab25和Rab25B过度表达对卵巢癌侵袭转移表型的影响。结果1.LCM结合RNA线性扩增技术成功获取足量的、完整性好、可用于下游高通量筛选的靶细胞RNA,是一条获得高质量RNA可行的技术路线。2.应用cDNA微矩阵分析LCM的卵巢癌肝转移肿瘤细胞的基因表达谱,初步筛选出了458条差异表达的卵巢癌肝转移效应基因。最感兴趣的首次发现是,转移抑制因子CD9和囊泡运输重要的调节因子Rab25在肝转移灶中高度表达。3.CD9和Rab25 mRNA的表达水平,在卵巢癌腹腔不同脏器转移灶中较原发灶至少增加7倍,在卵巢癌细胞系A2780较Skov-3明显上调。CD9 mRNA在高转移潜能的肿瘤细胞系MDA-MB-231,PC-3M-1E8及其PG-BEl的表达水平较低转移潜能的肿瘤细胞系MCF-7,PC-3M-284及其PG-LH7明显下调,而Rab25mRNA的表达水平在PC-3M-1E8及其PG-BE1明显增加,在MDA-MB-231中低表达,表明CD9和Rab25基因的异常表达与肿瘤转移密切相关,且在卵巢癌二者过度表达促进肿瘤转移。将构建Rab25载体的测序结果和数据库Rab25基因（nm₀20387）进行对比分析,首次发现Rab25基因新的剪切变异体,命名为Rab25B,成功构建了CD9、Rab25和Rab25B全长真核农达载体,获得稳定表达CD9、Rab25和Rab25B的卵巢癌细胞克隆株。4.卵巢浆乳癌肿瘤细胞无论是在原发灶、脉管内还是转移灶中均以独特的集团性的方式存在,据此本研究首次将其称为“肿瘤细胞的集团性浸润、转移”,结合CD9在晚期浆乳癌转移灶中过度表达,其表达模式与E-cadherin的表达模式相同,且与肿瘤分级、临床分期以及患者的预后密切相关,可推断CD9可能通过E-cadherin介导肿瘤细胞以集团性运动独特方式促进卵巢癌转移的。5.通过转染技术使人卵巢癌SKOV-3细胞过表达CD9,能够促进细胞体外增殖和运动能力,可能是通过上调P14K/AKT胞内信号对SKOV-3细胞发挥作用的。6.过表达外源性Rab25,通过活化AKT、调控内化的E-cadherin的再循环,降低E-cadherin/catenin复合物形成,改变了细胞极性和组织结构,促进人卵巢癌A2780细胞的转移表型;反之,Rab25B的过表达逆转了A2780细胞的转移表型。7.动物体内实验表明,过表达外源性Rab25增强卵巢癌细胞成瘤性,促进肿瘤细胞盆腹腔种植性转移和胸腔纵隔远处转移;反之,Rab25B的过度表达逆转卵巢癌细胞的转移表型。结论采用LCM技术从卵巢浆乳癌原发灶及其肝转移灶的冰冻组织切片中原位特异捕获肿瘤细胞,微量抽提的RNA经RNA线性扩增,应用Agilent高通量含有1.9万基因的聚寡核苷酸表达谱芯片分析LCM卵巢癌肝转移肿瘤细胞的基因表达谱,初步筛选出了卵巢癌肝转移差异表达的效应基因。选择了在肝转移灶中高度表达的转移抑制因子CD9和囊泡运输重要的调节因子Rab25作进一步研究。验证CD9和Rab25在不同高低转移配对肿瘤细胞株以及卵巢癌原发灶和配对转移灶中的表达显示,CD9和Rab25基因的异常表达与不同肿瘤转移密切相关,更重要的是,在卵巢癌,二者过度表达与肿瘤转移潜能呈正相关。在验证实验中首次发现:Rab25基因新的剪切变异体,本研究中命名为Rab25B,其功能结构域第二个外显子196个碱基丢失;CD9的表达在晚期浆乳癌转移灶中不是丢失,而是再次过度表达,并且与肿瘤分级、临床分期以及患者预后密切相关,其表达模式与E-cadherin的表达模式相同。进一步探讨CD9、Rab25和Rab25B基因参与卵巢癌侵袭转移的分子机制发现:外源性CD9过表达,上调P14K/AKT胞内信号,促进人卵巢癌SKOV-3细胞的体外增殖和运动能力;Rab25的过表达活化AKT,调控内化的E-cadherin的再循环,从而改变E-cadherin/catenin复合物维持细胞极性和组织结构的功能,促进人卵巢癌A2780细胞的转移表型;反之,Rab25B的过表达逆转了A2780细胞的转移表型。动物体内实验也证实Rab25过表达增强卵巢癌增殖,促进卵巢癌盆腹腔种植转移及胸腔纵隔远处转移;反之,Rab25B的过度表达逆转卵巢癌细胞的转移表型。综上所述,CD9可能是通过E-cadherin介导肿瘤细胞以集团性侵袭转移独特方式参与卵巢癌转移的;Rab25和Rab25B在卵巢癌转移中的作用相反,Rab25基因的第二个外显子是Rab25促进肿瘤转移的重要功能区。所以CD9和Rab25是有效的抗侵袭转移的分子治疗靶标,特别是Rab25的第二个外显子是卵巢癌抗侵袭转移更精确的靶点。