胃癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,根据2018年2月中国国家癌症中心发布的最新数据,我国胃癌发病率居全国恶性肿瘤第二位,其中男性居第二位,女性居第五位。死亡率居全国恶性肿瘤第三位,其中男性居第三位,女性居第二位。超过80%胃癌患者确诊时疾病已至晚期,预后较差。目前胃癌的基本诊断手段包括胃镜下黏膜活检病理学检查以及影像学检查,分别用于胃癌的定性诊断、定位诊断以及治疗前的分期诊断(c TNM)。胃镜下黏膜活检病理学检查是胃癌确诊和治疗的依据,影像学检查中胸腹盆腔增强CT检查是治疗前分期的基本手段。此外,色素内镜、放大内镜、超声内镜、腹部磁共振(MRI)、单光子发射计算机断层成像(SPECT)和正电子发射断层成像(PET)等也用于胃癌的诊断及远处转移的评估。现有的内镜及影像技术由于是基于病变形态学的改变为主,有一定的漏诊率及误诊率。众所周知,肿瘤细胞及组织在出现形态学改变之前往往已发生分子生物学改变,因此寻找新的胃癌标志物、开创新型内镜检查技术、探索跨学科前沿领域或将有利于胃癌的早期诊断及早期治疗。近年来分子影像学作为一门新兴学科,开辟了肿瘤诊断的新视角,可以无创性、实时检测病变组织在细胞甚至分子水平的改变,达到“活体内免疫组化”的效果,它的出现为肿瘤的诊断和治疗带来了一场新的革命。实现分子显像首先要找到成像靶点,即分子标志物。在许多潜在的分子标志物中,与肿瘤微环境密切相关的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)引起越来越多学者的关注。MMPs是一个包含24种锌依赖的肽链内切酶家族,其主要功能是降解细胞外基质的成分。近年来研究发现MMPs在人类多种恶性实体肿瘤中表达上调,尤以MMP-2研究较多。一项囊括了10项临床研究的Meta分析发现,MMP-2高表达与胃癌患者TNM分期、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、中位生存期显著相关,MMP-2高表达可能可以作为胃癌预后不良的肿瘤指标。现有的MMP-2检测手段如免疫组织化学法、抗体标记以及蛋白质组学方法可用于检测和跟踪固定细胞或体外酶,但不能提供活细胞中酶的实时信息,限制了其临床应用。小分子荧光探针成像技术具有灵敏度高、无创性快速分析以及活体内实时检测等优点,已经广泛应用于活体内多种动态过程的可视化和定量研究。探针的荧光性质可以通过其分子结构来调节,这使得设计的探针在与某种酶的相互作用下,其光谱特性发生了显著的变化,表现出高的信号强度比和高灵敏度。因此,小分子荧光探针已经成为一种强大的工具,可以实时检测活体中特异性酶的位置和含量并形成可视化荧光图像,在癌症的早期诊断和治疗中具有巨大的潜力。在本研究中,我们首先合成了MMP-2特异性小分子荧光探针Dab-GPLGVRGY-FITC,并检测了其灵敏度、特异性及细胞毒性。然后,将该探针应用于新鲜胃癌组织的成像。接下来我们将该探针与人胃癌细胞株(MGC-803)孵育,并在荧光共聚焦显微镜下观察癌细胞的荧光成像。为了评估该探针能否用于活体动物的肿瘤部位荧光成像,我们进一步将该探针通过尾静脉注射至胃癌荷瘤裸鼠体内,在小动物活体成像系统(IVIS)中观察其荧光成像。本研究完成了小分子荧光探针的制作、胃癌临床标本成像、胃癌细胞成像以及胃癌荷瘤动物模型成像,为小分子荧光探针进一步转化为临床应用提供了初步的实验依据。第一部分MMP-2特异性小分子荧光探针的合成及其灵敏度、特异性和细胞毒性检测目的设计并合成MMP-2特异性小分子荧光探针,并检测其灵敏度、特异性及细胞毒性。方法MMP-2特异性多肽底物(GPL-GVRGY-Pra)分别经过Cu(I)催化“点击”化学反应和酰胺化反应与荧光团FITC-N3和Dabcyl琥珀酰亚胺酯偶联制备得到小分子荧光探针Dab-GPLGVRGY-FITC;将该探针与MMP-2、MMP-2抑制剂以及常见活性酶(Furin、DNase、RNase、BSA)反应并用荧光光谱仪检测其荧光强度以判断探针对MMP-2的特异性;将该探针与不同浓度MMP-2反应并用荧光光谱仪检测其荧光强度以判断其检测MMP-2的灵敏度;采用MTT法检测该探针对人胃癌细胞株MGC-803的细胞毒性。结果高效液相色谱分析仪纯化图显示该探针纯度在95%以上,并经高分辨质谱确证;荧光光谱仪检测结果显示探针本身荧光强度微弱,而与MMP-2反应后其荧光强度明显增强(较探针本身荧光强度高出40倍),且该荧光信号可被MMP-2抑制剂阻断;探针与MMP-2反应溶液的荧光强度随着MMP-2浓度的增加呈线性增强,其最低检测限达14ng/ml;探针与其他生物酶(Furin、DNase、RNase、BSA)反应后溶液荧光信号的强度微弱。MTT法细胞毒性实验发现该探针浓度在1μM之内时,MGC-803细胞与探针孵育后存活率几乎没有变化,当探针浓度增大至10μM时,其存活率约85%,当探针浓度增大至100μM时,其存活率仍能维持在70%左右。结论本实验设计并合成了MMP-2特异性小分子荧光探针Dab-GPLGVRGY-FITC,该探针具有高灵敏度、高特异性以及低细胞毒性的特点。第二部分小分子荧光探针Dab-GPLGVRGY-FITC在离体胃癌组织中的成像目的评估第一部分中合成的小分子荧光探针Dab-GPLGVRGY-FITC能否通过识别MMP-2对离体胃癌组织形成荧光图像。方法将该探针分别与11例新鲜胃癌组织及其癌旁组织以及1例胃炎黏膜组织进行反应,通过荧光光谱仪检测各组织标本、组织裂解液的荧光强度,再通过荧光共聚焦显微镜观察组织冰冻切片的荧光强度。结果胃癌组织块与小分子荧光探针Dab-GPLGVRGY-FITC反应后的荧光强度明显高于其癌旁组织以及胃炎组织。而预先加入了MMP-2抑制剂的胃癌及癌旁组织块与探针反应后荧光信号明显减弱。胃癌组织裂解液与探针反应后具有极强的荧光信号,其荧光吸光度是胃炎组织裂解液的5.8-9.0倍,平均7.53±0.77倍;而癌旁组织荧光信号微弱,其荧光吸光度是胃炎组织裂解液的1.0-3.1倍,平均2.07±0.64倍。经统计学分析,两组有统计学差异(p<0.05)。根据第一部分中MMP-2剂量与荧光吸光度的线性关系计算出胃癌组织中活性MMP-2的含量为1.26ng/mg,而癌旁组织中活性MMP-2的含量为0.228ng/mg。胃癌组织块与探针反应后,其冰冻切片在荧光共聚焦显微镜下可观察到明显的绿色荧光,而癌旁组织及胃炎组织切片荧光信号微弱。当组织中MMP-2的活性被抑制后,胃癌及癌旁组织的荧光信号明显减弱。结论小分子荧光探针Dab-GPLGVRGY-FITC可以通过识别MMP-2对离体胃癌组织形成荧光图像,根据其荧光强度可以鉴别胃癌组织、癌旁组织及胃炎组织。第三部分小分子荧光探针Dab-GPLGVRGY-FITC在人胃癌细胞株MGC-803中的成像目的评估第一部分中合成的小分子荧光探针Dab-GPLGVRGY-FITC能否通过识别MMP-2对胃癌细胞MGC-803形成荧光图像。方法将浓度为2μM、4μM、8μM的该探针分别与MGC-803细胞孵育,在荧光共聚焦显微镜下观察细胞的荧光成像;将浓度为4μM的该探针与人源性胃黏膜上皮细胞(GES-1)进行孵育作为对照,将相同浓度的该探针以及预先添加了MMP-2抑制剂的探针分别与MGC-803细胞孵育,在荧光共聚焦显微镜下观察其荧光成像。结果当探针浓度为2μM时,MGC-803细胞中即可出现明显的荧光信号,且随着探针浓度的增加,荧光信号逐渐增强。GES-1细胞与浓度为4μM的探针孵育后无明显荧光信号,MGC-803细胞与相同浓度的探针孵育后出现明显的荧光信号,而预先加入了MMP-2抑制剂的MGC-803细胞与相同浓度探针孵育后,其荧光信号明显减弱。结论小分子荧光探针Dab-GPLGVRGY-FITC可以通过识别MMP-2对胃癌细胞MGC-803形成荧光图像。第四部分小分子荧光探针Dab-GPLGVRGY-FITC在胃癌荷瘤裸鼠中的成像目的评估第一部分中合成的小分子荧光探针Dab-GPLGVRGY-FITC能否通过识别MMP-2对胃癌荷瘤裸鼠的肿瘤组织成像,并初步评估其对机体的毒性。方法将该探针过通过尾静脉注射至胃癌荷瘤裸鼠体内,在小动物活体成像系统(IVIS)中进行成像。进一步取出肿瘤组织及重要脏器在IVIS中观察。采集探针组裸鼠血液进行血常规、生化检测,并与对照组比较。结果胃癌荷瘤裸鼠经尾静脉注射该探针后,在IVIS系统中仅15min肿瘤部位就出现荧光信号,且随着时间推移肿瘤区域荧光信号逐渐增强;离体肿瘤组织在IVIS中荧光信号也明显增强,且该荧光信号可被MMP-2抑制剂阻断。探针组裸鼠血常规与对照组相比,红细胞计数(RBC)及血小板计数(PLT)减少具有统计学意义(P<0.05),分别为(4.88±0.05 vs 5.20±0.04)×1012/L、(612±8.60 vs 657.5±4.95)×109/L。而白细胞计数(WBC)、血红蛋白(HB)与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。探针组裸鼠生化结果与对照组相比,谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)升高具有统计学意义(P<0.05),分别为(49.66±3.39 vs 34.75±0.64)U/L、(32.27±2.94vs 17.18±0.21)U/L。而碱性磷酸酶(ALP)及γ-谷氨酰转肽酶(GGT)及总胆红素(TB)与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。探针组裸鼠血肌酐(Scr)结果与正常裸鼠相比升高(P<0.05),为(55.72±1.80 vs 54.10±0.50)mmol/L。而血糖(GLU)、总胆固醇(TC)与对照组无统计学差异(P>0.05)。结论小分子荧光探针Dab-GPLGVRGY-FITC可以通过识别MMP-2对胃癌荷瘤裸鼠的肿瘤组织形成荧光图像,该探针可能有一定的肝肾毒性。