论文部分内容阅读
冬虫夏草Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.作为一种名贵的中药材已有数百年的历史,在传统中医里常与人参、鹿茸一同并称为三大滋补圣品,具有巨大的市场潜力和药用价值。本研究以发酵冬虫夏草菌粉多糖(CSP)为研究对象,检测其对结肠癌细胞系HCT-116生长增殖的影响,并通过转录组测序(RNA-seq)和生物信息学技术分析其抗肿瘤的机制。结果显示CSP可能通过诱导癌细胞凋亡和自噬发挥抗癌作用。随后进一步通过AO-EB染色、Western blot和mRFP-eGFP-LC3双荧光报告基因对此推测进行验证,并结合RNA-seq数据探究CSP诱导凋亡和自噬的信号通路。最后,本研究结合自噬抑制剂,深入探讨了CSP诱导HCT116细胞凋亡和自噬之间的关联。主要研究结论如下:1.通过CCK-8法检测CSP抗结肠癌细胞HCT-116增殖的效果。结果显示CSP对结肠癌细胞的增殖具有显著的抑制作用,且呈剂量、时间依赖性,但对正常细胞IEC-6不表现细胞毒性。2.采用RNA-seq和生物信息学技术分析CSP对HCT-116细胞基因表达及其信号通路的影响。结果显示,800μg/mL CSP处理组与对照组之间的显著差异表达基因共有856个,其中330个基因表达上调,526个基因表达下调。GO富集分析和GSEA基因集富集分析结果显示:自噬、凋亡、葡萄糖剥夺和细胞死亡等基因集在CSP处理后显著上调,而自噬体的形成、溶酶体等基因集在CSP处理后显著下调。3.CSP处理显著增加HCT-116的细胞凋亡率和细胞自噬率,上调凋亡和自噬相关基因蛋白的表达。基于mRFP-eGFP-LC3双荧光转染和自噬抑制剂实验,本研究发现CSP诱导自噬的发生,同时也抑制溶酶体的形成,并通过抑制自噬溶酶体的形成在自噬的降解阶段造成自噬流阻塞。这些结果表明,CSP诱导HCT-116细胞发生凋亡和自噬,并部分阻塞细胞自噬流。4.基于RNA-seq数据进一步探究CSP诱导细胞自噬和凋亡的分子机制。实验结果显示,CSP降低了 PI3K的表达和AKT、mTOR的磷酸化水平,增加了AMPKa的表达和ULK1的磷酸化水平。总而言之,CSP可能通过调控AMPK-mTOR-ULK1和PI3K-AKT-mTOR信号通路诱导细胞凋亡和自噬。5.结合自噬抑制剂验证自噬在CSP抑制HCT-116细胞增殖过程中的作用机制。数据显示,阻塞自噬流能够促进CSP诱导的癌细胞凋亡和癌细胞死亡,但是抑制自噬的发生对CSP诱导的癌细胞死亡并无明显的影响。这些数据说明CSP通过诱导细胞凋亡和自噬流的阻塞来抑制癌细胞的增殖,并且可能是通过调控PI3K-AKT-mTOR 和 AMPK-mTOR-ULK1 信号通路实现。