喉癌是耳鼻咽喉科常见恶性肿瘤，发病率高，在我国约占全身肿瘤的1—2％，占耳鼻咽喉恶性肿瘤的11—22％。早期喉癌治疗以手术或放疗为主，中晚期喉癌多采用以手术为主的综合治疗，尽管20世纪80年代以来，喉癌的治疗取得了较大的进展，手术、放疗、化疗和免疫治疗的联合应用，大大提高了患者的5年生存率和生活治疗。但手术、放疗和化疗致残率高、并发症多、毒副作用大，手术后复发和转移仍是喉癌患者的主要致死原因，5年生存率的进一步提高似乎进入瓶颈，难以有突破性进展。因此寻找新的有效、简便、毒副作用小的治疗方法成为耳鼻咽喉科工作者关注的焦点，尤其是肿瘤形成早期和治疗后肿瘤负荷小的情况下，对亚临床病灶的恰当处理，是避免恶性肿瘤复发、转移，和提高5年生存率的关键。对于手术或放疗后的亚临床病灶的处理，是影响恶性肿瘤预后的关键步骤，也是人们近年来研究的热点。肿瘤生物治疗(Biotheropy)是应用现代生物技术及其产品进行肿瘤防治的新疗法，它通过调动宿主的天然防卫机制或给予天然(或基因工程)产生的针对性靶向性很强的物质来取得抗肿瘤的效应。随着对肿瘤发生发展分子机制的深入研究和生物技术的发展，生物治疗已经成为肿瘤综合治疗中的第四种模式。恶性肿瘤的生物治疗主要有：基因治疗，肿瘤疫苗治疗，生物反应调节剂治疗等。其中基因治疗不仅能够使恶性肿瘤细胞的恶性表型逆转，抑制肿瘤生长，而且可以使受到损伤的细胞得以修复，去除引起突变的始动因素，是一种直接有效的治疗。这种治疗应用于临床，已经取得可喜的成果。但传统肿瘤基因治疗的转染效率低、靶向性差、抗癌基因表达量低的缺点。为解决以上缺点，近年来RNAi干扰技术被应用于恶性肿瘤基因治疗的试验研究。其原理是小片段RNA(siRNA)利用碱基互补的原理，特异性地结合癌基因的mRNA，干扰其翻译、转录形成蛋白质的功能，阻抑癌蛋白的生成。使癌细胞向成熟方向分化或诱导细胞凋亡，从而达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。RNAi技术是在核酸水平改变肿瘤操控基因的治疗方法，特异性强，副作用小，有希望成为新的基因治疗途径。Survivin是新近发现的LAP家族成员之一，是目前发现的抗凋亡能力最强的凋亡抑制因子，具有不同于IAP家族其他成员的独特性质和结构，在正常成人组织中不表达而选择性地表达于恶性肿瘤组织，且与肿瘤细胞的分化增殖及浸润转移密切相关，这种独特的表达特性及其与恶性肿瘤发生、发展的密切关系，使其成为恶性肿瘤诊断与治疗的新靶点。基于以下目的：1．探讨survivin基因在喉癌组织中的表达及其与喉癌发生、发展和转移的关系；2．观察利用RNAi技术敲除喉癌细胞中survivin基因对喉癌细胞凋亡的影响，3．RNAi技术作用于活体喉癌细胞的效果；4．RNAi技术应用于活体的安全性。本研究用免疫组织化学方法检测喉鳞癌标本中survivin及其它凋亡相关基因的表达及其和喉癌临床特点的关系，探讨它们在喉癌的发生、发展中的作用。建立以survivin基因为目的基因，质粒为载体的siRNA，脂质体包埋，转染喉癌Hep-2细胞，观察转染后细胞的生长情况、survivin的表达和细胞凋亡。建立Hep-2细胞裸鼠模型，静脉途径给药，观察瘤体增长情况，瘤细胞内survivin的表达和细胞凋亡。方法1．采用免疫组化检测人喉鳞癌细胞中survivin，caspase—3，bcl—2，bax，p53基因的表达。2．采用细胞免疫化学法观察survivin蛋白在喉癌Hep-2细胞系中的表达情况。3．脂质体包埋survivin RNA，转染喉癌hep-2细胞。采用western-blotting方法检测survivin siRNA转染后对喉癌Hep-2细胞中survivin蛋白水平的影响。4．采用RT-PCR方法检测不同浓度、不同作用时间survivin siRNA对survivinmRNA表达的影响。5．采用甲基偶氮唑盐光吸收法(MTT)检测survivin siRNA转染前后对喉癌Hep-2细胞增殖的影响。6．紫杉醇、紫杉醇+siRNA转染组作用喉癌Hep-2细胞，应用流式细胞仪对对照组和处理组进行细胞周期和凋亡分析。7．建立裸鼠种植瘤模型。于裸鼠前腿背侧注入Hep-2细胞(2×10~7／ml，0.2 ml／只)，成瘤后随机分为A、B、C三组，分别给予PBS 200μl，紫杉醇200μl，紫杉醇+siRNA200μl腹腔注射。8．免疫组织化学检测裸鼠种植瘤PBS组、紫杉醇组、紫杉醇+siRNA组survivin蛋白的表达情况。9．应用凋亡的原位酶标记检测(TUNEL)检测裸鼠种植瘤治疗前后细胞凋亡的变化。10．观察给药后各组裸鼠饮食、精神状态；检测血常规及肝肾功能；在光镜下观察到裸鼠的心、肝、脾、肾等主要脏器。判断给药后有无毒副作用。11．应用spss11.0和sas9.0统计软件进行统计学处理。对记数资料采用x~2检验或Fisher精确检验、Spearman相关性分析。计量资料采用均数士标准差((?)±s)表示，多个样本均数比较应用单因素方差分析，两样本均数比较采用t检验。检验水准P=0.05。结果1．人喉鳞癌组织免疫组化检测结果显示：survivn(71.8％)，bcl—2(47.3％)，p53(62.7％)在喉鳞癌细胞中表达增强，caspase—3，bax蛋白表达下降。这种异常表达与喉鳞癌的发病及恶性表型关系密切。2．细胞免疫化学结果显示：survivin蛋白在喉癌Hep-2细胞系中阳性表达。3．western-blotting结果显示：survivin siRNA转染喉癌Hep-2细胞24h、48h、72h后提取细胞蛋白进行western-blotting分析，结果显示随着时间延长survivin蛋白表达水平逐渐降低。4．RT-PCR扩增结果显示：不同时间、不同浓度的survivin siRNA对目的基因mRNA的表达均有影响。随着时间的延长和浓度的增加，survivin mRNA的表达逐渐减弱。5．四甲基偶氮唑盐光吸收法(MTT)的结果：不同浓度、不同时间survivin siRNA转染Hep-2细胞后，SDH活性受抑制情况与对照组相比差异有显著性(P＜0.05)。联合应用紫杉醇之后，对Hep-2细胞SDH活性的抑制作用更明显(P＜0.01)。提示二者有协同作用。6．流式细胞仪对细胞周期检测的结果：紫杉醇、siRNA转染、紫杉醇+siRNA转染分别处理细胞48h后的结果显示：S期细胞的百分比各组分别依次为：对照组36.1％，siRNA转染组19.2％，紫杉醇+siRNA转染组13.8％，下降趋势明显(P＜0.05)，紫杉醇+siRNA转染组效果最显著。7．对照组，紫杉醇组，紫杉醇+siRNA转染组裸鼠体重和肿瘤体积在治疗前具有均衡性。治疗后，对照组，紫杉醇组，紫杉醇+siRNA转染组体重与对照组相比差异有显著性(23.0g，19.6g，17.9g，p＜0.05)；各组裸鼠肿瘤体积均逐渐增大，对照组肿瘤无限制生长，统计学分析显示治疗结束后，对照组，紫杉醇组，紫杉醇+siRNA转染组体积缩小有显著差异(1749.5mm~3，863.9mm~3，613.9mm~3，p＜0.05)；紫杉醇+siRNA转染组和其它治疗组相比，肿瘤体积缩小最明显。8．裸鼠肿瘤组织survivin蛋白的免疫组化测定结果显示：对照组survivin蛋白强表达，紫杉醇组，紫杉醇+siRNA转染组survivin蛋白阳性细胞数减少(311，158，102，p＜0.05)。紫杉醇+siRNA转染组survivin蛋白减弱最明显。9．裸鼠移植瘤组织中细胞凋亡的检测结果(TUNEL法)：阳性细胞数按对PBS组、紫杉醇组、紫杉醇+siRNA组顺序依次增多(6，35，87)。经统计学处理，组间差异显著(P＜0.05)10．通过对给药后毒副作用观察，发现各组裸鼠饮食正常、精神状态良好；血常规及肝肾功能与治疗前无显著性差异；在光镜下观察到裸鼠的心、肝、脾、肾等主要脏器无异常改变。结论1．人喉鳞癌组织中survivn，bcl—2，p53表达增强，caspase—3，bax蛋白表达下降。这种异常表达可能与喉鳞癌的发生及恶性表型有关。2．survivn siRNA可有效的沉默喉癌Hep-2细胞的survivn基因，下调survivin蛋白及mRNA的表达水平，诱导凋亡并对细胞的增殖有抑制作用。3．survivin siRNA与紫杉醇联合应用，二者具有协同作用，可有效地阻止细胞增殖，促进细胞凋亡。4．成功构建了裸鼠喉癌移植瘤模型。体内研究显示：survivn siRNA可以促进肿瘤细胞的凋亡，抑制裸鼠体内肿瘤的生长，有效起到抗肿瘤作用。5．survivin siRNA应用于小鼠，未见明显毒副作用，不影响正常生长，对重要脏器无明显损伤。