论文部分内容阅读
目的:参芪扶正注射液为临床常用中药注射剂,是黄芪和党参的提取物。参芪扶正注射液除了具有抑制血栓、提高回心血流量、降压、调节机体免疫等作用外,还具有化疗增敏及减轻化疗药物毒性的作用,但其化疗增敏的机制尚不清楚。本研究以人肺腺癌细胞株(A549)及顺铂耐药的人肺腺癌细胞株(A549/DDP)为模式细胞,分别利用免疫组织化学、Western blot、流式细胞术等技术,探究参芪扶正注射液改善肺癌顺铂耐药的分子机制,为寻找中西医结合治疗肺癌的有效干预靶点提供实验依据,同时为丰富肺癌耐药病机与治法理论提供新的思路与方法。材料与方法:1.实验材料人肺腺癌细胞株(A549)、人肺腺癌顺铂耐药细胞株(A549/DDP)购自中国医学院肿瘤研究中心(北京),参芪扶正注射液(丽珠集团利民制药厂,珠海,生产批号:146195,注射剂,250 m L),顺铂冻干粉(齐鲁制药有限公司,山东,生产批号:2030132DB,冻干粉,10 mg)。2.实验方法A549、A549/DDP细胞株于37℃、95%湿度、5%CO2条件下培养在含10%FBS、青霉素和链霉素各100 U/m L的RPMI-1640培养基中,0.25%胰蛋白酶消化传代。A549/DDP细胞置于2μg/m L顺铂浓度中维持其耐药性。A549/DDP细胞分为5组:对照组(PBS)、顺铂组(40μg/m L)、顺铂+低浓度参芪扶正注射液组(40μg/m L+2 mg/m L)、顺铂+中浓度参芪扶正注射液组(40μg/m L+3.78 mg/m L)、顺铂+高浓度参芪扶正注射液组(40μg/m L+35.18 mg/m L)。(1)CCK-8法检测A549、A549/DDP细胞株顺铂耐药性差异;并利用Western blot、免疫组织化学方法比较A549、A549/DDP两株细胞中线粒体外膜融合蛋白(mitofusin-2)表达的差异;(2)取低表达Mfn2的A549/DDP细胞,以不同浓度的参芪扶正注射液进行干预:1)利用CCK-8法观察参芪扶正注射液对A549/DDP细胞增殖的抑制作用;2)参芪扶正注射液干预A549/DDP细胞细胞周期相关指标的检测:分别利用低、中、高浓度参芪扶正注射液(2、3.78、35.18 mg/m L)联合顺铂(40μg/m L)干预A549/DDP细胞,分别利用流式细胞术检测细胞周期DNA含量变化、Western blotting检测细胞周期蛋白分子p21、p53的表达;3)参芪扶正注射液诱导A549/DDP细胞凋亡相关指标的检测:分别利用低、中、高浓度参芪扶正注射液联合顺铂干预A549/DDP细胞,利用免疫荧光染色法观察细胞核的变化、AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡、Western blotting方法检测凋亡相关蛋白(半胱氨酸天冬氨酸酶——Cleved-caspas 3、多聚ADP核糖聚合酶——Cleved-PARP、Bcl-2、Bax)的表达。4)参芪扶正注射液干预A549/DDP细胞周期、诱导细胞凋亡分子机制的检测:分别利用低、中、高浓度参芪扶正注射液联合顺铂干预A549/DDP细胞,分别利用Western blotting检测Mfn2的表达、流式细胞术检测线粒体膜电位及细胞内活性氧(Reactive Oxidative Species,ROS)的变化。结果:1.与A549细胞相比,顺铂耐药的A549/DDP细胞表达更低水平的Mfn2。2.参芪扶正注射液具有降低A549/DDP细胞顺铂耐药指数的作用。3.参芪扶正注射液联合顺铂干预A549/DDP细胞,具有上调p21及p53的蛋白表达,使细胞周期阻滞于G2/M,从而逆转A549/DDP细胞顺铂耐药性。4.参芪扶正注射液联合顺铂干预A549/DDP细胞,具有通过上调Bax、下调Bcl-2表达,诱导细胞发生凋亡,从而逆转A549/DDP细胞顺铂耐药性。5.参芪扶正注射液联合顺铂干预A549/DDP细胞可通过上调Mfn2表达,干预细胞周期、抑制细胞凋亡,且这种干预作用与线粒体通透性增加及ROS升高有关。结论:参芪扶正注射液联合顺铂干预非小细胞肺癌细胞,可通过上调Mfn2蛋白促进细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡,从而增加非小细胞肺癌细胞对顺铂的敏感性。