研究背景:鼻咽癌是起源于鼻咽表面和腺的上皮细胞的恶性肿瘤。全世界约80%的鼻咽癌都发生在中国,特别多见于广东、广西、湖南、以及福建省。鼻咽癌最常见于30岁至50岁之间。放疗、化疗是鼻咽癌目前主要的治疗方法,但其远期疗效尚不令人满意,放疗和化疗后的5年生存率仅为50%～70%,放化疗耐受和严重的并发症降低了鼻咽癌联合治疗的效果。因此迫切需要寻找到疗效更好的,毒副作用更小的抗鼻咽癌治疗药物。中药化香树果,为胡桃科植物化香树Platycarya strobilacea Sieb.et Zucc的果实,已经报道有多种药理作用,例如抗炎、抗氧化、抗血管生成等。《中华本草》、《中药大辞典》等典籍记载其有清除热邪,排除浅表邪,活血化瘀,散风邪的功效。在民间它已被作为治疗鼻窦炎和预防鼻咽癌的有效药物。我们课题组前期通过乙醇提取法提取了化香树果序的有效成分并进行了分离鉴定,同时我们通过前期研究发现,这种化香树果序醇提取物(PSZ)能够抑制人鼻咽癌细胞CNE1、CNE2的增殖以及诱导细胞细胞质出现大量液泡的积累,导致细胞代谢能力下降,细胞膜失去其完整性,最终细胞死亡。PSZ诱导的这种细胞死亡现象中没有观察到细胞皱缩,染色质浓缩,核碎裂等与凋亡、坏死、自噬密切相关的现象,按照细胞死亡命名委员会提出形态分类(NCCD)(2009),我们认为PSZ诱导鼻咽癌细胞发生了一种新的死亡方式,即“methuosis”。我们以往的研究表明,PSZ通过RAS和RAC1的持续活化诱导了methuosis的发生。并且通过使用选择性RAC1抑制剂EHT1864可逆转PSZ诱导的methuosis死亡现象。本研究中,我们进一步研究了 PSZ在体内外的抗肿瘤作用,同时发现PSZ作用于鼻咽癌细胞CNE1和CNE2后,ARF6、p-ERK,c-Fos,p-Dusp1蛋白表达水平降低。此外,我们发现分别使用c-Fos和DUSP1抑制剂作用鼻咽癌细胞后能抑制细胞增殖,并诱导细胞质产生大量空泡,产生类似于methuosis死亡的现象,而当过表达ARF6及c-Fos时,同样可以逆转PSZ诱导的液泡在细胞质中的大量积累,提示ARF6、c-Fos和DUSP1在PSZ诱导的Methuosis死亡中发挥了重要靶点的作用。根据这一系列的研究,我们认为化香树果序醇提物可能通过抑制ARF6/ERK1/2/c-Fos/DUSP1通路发挥肿瘤抑制的功能。研究目的:通过体内外实验研究明确化香树果序醇提物的抗肿瘤活性,进一步探讨化香树果序醇提物诱导鼻咽癌细胞发生Methuosis死亡的相关信号通路,明确作用靶点,阐述其作用机制,推进化香树果序的后续研究及临床应用。研究方法:第一部分化香树果序醇提物抑制鼻咽癌细胞CNE1/2的增殖活性并诱导其发生Methuosis死亡1、细胞培养与药物处理2、MTT实验测定化香树果序醇提物对人鼻咽癌细胞增殖抑制作用3、平板克隆形成试验4、倒置显微镜观察化香树果序醇提物作用后细胞形态的改变5、荧光黄标记实验检测化香树果序醇提物对细胞内吞功能的影响第二部分 化香树果序醇提物通过ARF6/ERK1/2/c-Fos/DUSP1通路诱导鼻咽癌细胞CNE1/2发生Methuosis死亡的机制研究1、高通量RNA测序分析PSZ处理组与对照组基因的表达差异2、荧光实时定量PCR(Real-time qPCR)检测相关基因表达的情况3、下拉实验检测H-RAS/ARF6激活状态4、Western Blot检测ARF6、ERK1/2、c-Fos、DUSP1等相关蛋白表达差异5、细胞免疫荧光实验观察化香树果序醇提物作用后c-Fos在细胞的表达6、CCK8法检测化香树果序醇提物及相关抑制剂对细胞的增殖抑制作用第三部分 裸鼠鼻咽癌肿瘤模型的建立与相应指标的检测1、裸鼠成瘤及药物处理2、计算裸鼠成瘤率及药物抑瘤率3、免疫组织化学染色(IHC)检测组织相应指标的表达结果:1、化香树果序醇提物抑制CNE1和CNE2细胞增殖,并诱导细胞过度的内吞化香树果序醇提物作用于人鼻咽癌细胞株CNE1/CNE2 24h,48h后,倒置显微镜观察细胞质内大量液泡集聚,且随着药物作用时间的延长,可见细胞膜相互融合,不断增大,最后失去其完整性,细胞裂解死亡。这与自噬、凋亡、坏死有明显区别。提示化香树果序醇提物诱导鼻咽癌细胞发生了一种新的死亡方式,即“Methuosis”。MTT实验结果显示PSZ对鼻咽癌细胞的增殖抑制作用呈时间、浓度依耐性,且在实验的6个浓度梯度中,当浓度为1mg/ml时,其对细胞的抑制作用最明显。这表明化香树果序醇提物对鼻咽癌细胞具有较强的细胞毒性作用。平板克隆形成实验分析显示加入1mg/ml化香树果序醇提物后与空白对照组相比导致了 85%至90%的菌落数减少,表明化香树果序醇提物明显抑制了鼻咽癌细胞的克隆形成,且对鼻咽癌细胞生存的长期影响是明显的。我们使用荧光示踪剂荧光黄Lucifer Yellow(LY)对鼻咽癌细胞进行标记,通过倒置荧光显微镜观察及流式细胞仪对细胞的平均荧光信号强度分析发现,PSZ+LY组细胞荧光信号强度与空白组及LY组相比明显增强,且PSZ+LY+细胞松弛剂组荧光信号强度高于其他组,说明PSZ诱导产生的大量液泡与其促进细胞内吞作用有关且这种内吞作用不依赖板状伪足的形成。2、PSZ通过ARF6/ERK1/2/c-Fos/DUSP1通路诱导鼻咽癌细胞CNE1/2发生Methuosis死亡根据高通量RNA测序结果分析,筛选出ARF6、DUSP1、ERK1/2、c-Fos等差异基因,使用GO和KEGG对这些差异表达基因的进一步分析表明,相关差异基因所在通路主要为RAS/RAC1/ARF6及MAPK信号通路。随后进行了qPCR验证,结果显示CNE1/2细胞经化香树果序醇提物处理后,ARF6、c-Fos基因表达量明显下降。Western blot结果显示,PSZ处理的CNE2细胞与对照细胞相比c-Fos、p-DUSP1蛋白水平显著下降,磷酸化ERK表达降低,而ERK总水平保持不变,说明MAPK信号通路被抑制,通过特异性siRNA下调ARF6表达后发现,ERK活性抑制,c-Fos表达明显降低。这些结果表明ARF6作为ERK、c-Fos的上游发挥影响。我们使用了小分子抑制剂T-5224(c-Fos蛋白抑制剂)和R0 31-8220(DUSP1抑制剂)对细胞进行处理。结果表明,T-5224或R0 31-8220处理鼻咽癌细胞后都可以明显抑制细胞增殖并诱导细胞内形成大量液泡,发生类似Methuosis现象,同时,通过分别过表达c-Fos与ARF6后,再使用1mg/ml PSZ处理细胞24h后发现,CNE2细胞中的液泡大大减少,methuosis现象被逆转。表明c-Fos和DUSP1在PSZ诱导的Methuosis死亡中发挥了重要的作用。因此,我们认为PSZ通过调节ARF6/ERK1/2/c-Fos/DUSP1诱导鼻咽癌CNE1、CNE2 细胞发生 methuosis 死亡。3、PSZ抑制裸鼠抑制瘤生长在实验结束后,解剖裸鼠,计算肿瘤体积及测量瘤重量,空白对照组和实验组裸鼠的体重均增加,差异无统计学意义(P>0.05),高浓度组与对照组比,肿瘤平均体积的差异有统计学意义(P<0.05)。肿瘤细胞在药物处理后第16天,肿瘤体积均显著增大(P<0.05)。高浓度组的移植瘤质量与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。同时高浓度组的移植瘤质量与低浓度组相比,差异也有统计学意义(P<0.05)。说明化香树果序醇提物抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长。4、取裸鼠移植瘤组织,分别制作对照组和药物处理组石蜡切片,通过免疫组化实验,在显微镜下观察目的蛋白的表达情况,并按标准进行评分。结果显示,化香树果序药物处理组与对照组相比,ARF6、c-Fos和p-DUSP1表达明显下调,与细胞水平一致,且差异有统计学意义。结论:一、PSZ抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导其发生Methuosis死亡二、化香树果序醇提物在体内也具有抗肿瘤活性,对人鼻咽癌裸鼠皮下移植瘤的生长具有抑制作用;三、PSZ通过抑制ARF6/ERK1/2/c-Fos/DUSP1信号通路抑制鼻咽癌细胞CNE1/2增殖并诱导Methuosis死亡