研究背景甲状腺机能亢进症(Hyperthyroidism,简称甲亢)是由多种原因引起的体内甲状腺分泌激素过多所致的机体神经、心血管、消化等系统兴奋性增高和代谢亢进为主要表现的一组内分泌疾病的总称。常见临床症状为多食易饥、体重减轻、乏力、心悸、心动过速、怕热、急躁、易激动,甲状腺常为弥漫性、对称性轻度至中度肿大,不少弥漫性甲状腺肿大患者常伴有不同程度的突眼症,重症患者未经适当治疗,又因感染、手术等各种应激而诱发甲状腺危象[1]。甲亢病因较为复杂,其确切发病机制尚未明确。中医将本病归于“瘿、瘿气”范畴。一般认为其发病原因首先在于患者素体阴亏,肾阴不足,阴虚阳亢,加上情志失调,变生阴虚火旺、气阴两虚、痰湿阻滞等病机,其病位涉及肝、肾、心、脾、肺,而以肝肾为主[引。甲亢常累及全身多系统、多器官,其中常见而又往往易被忽视的是肝脏损害。甲亢性肝损害的发病率高达37%～76.7%[3-5],相当多的甲亢患者伴有肝脏损害,引起肝功能异常、肝肿大,黄疸等。目前国内外西医治疗本病：以抗甲状腺药物、放射性131I、手术切除等疗法为主,均不能纠正免疫功能紊乱,都存在一定的局限性和不同的副作用。西药抗甲亢药物治疗虽有效,但疗程较长,停药后复发率高达50%-80%,甲状腺肿、突眼等症状不易控制,而且副作用较大,患者可出现过敏反应(如皮肤瘙痒、皮疹、发热等,约占1%-5%)、骨髓影响(白细胞减少、血小板减少、贫血等,1%左右)[6]及肝功能损害、关节痛、水肿、脱发等。手术治疗有一定的适应症和禁忌症,且易损伤甲状旁腺和喉返神经[7]。近10年来中医药治疗甲亢取得可喜的进展,辨证分型、治疗手段灵活多样,疗效肯定,尤其对因白细胞减少或肝损害而不能耐受西药治疗者,中药治疗更突显了其独有的优势与特色。因宁片为广州南方医院临床经验方,它是以中医理论为依据,借助现代科技,从药理学、病理学等多学科角度入手,筛选了上百种中草药,最终由黄芪、昆明山海棠、鳖甲、当归、生地、甘草等九味中药科学配伍研制而成,诸药相和,共奏养阴软坚,解毒散结之功。经临床观察表明：因宁片对阴虚型、痰湿型、血瘀型甲亢均具有较好的临床疗效,可以有效消除甲亢症状,快速修复机体各个系统的正常功能,全面提高自身的免疫功能,达到标本兼治的目的。而且初步试验显示：因宁片对肝脏具有保护作用,避免了甲亢本身以及抗甲状腺药物引起的肝损害,填补了抗甲亢药物防肝损害治疗的用药空白。本课题将结合毒理学、药理学、动物实验方法学和生物统计学等学科的研究方法和技术,进行因宁片的急性毒性和长期毒性实验研究,并通过回顾性分析临床甲亢病历资料,对甲亢性肝损害的临床相关因素进行分析,最终为因宁片的新药研发和临床甲亢的治疗提供实验依据。目的通过急性毒性实验,考察因宁片对小鼠的急性毒性,测出半数致死量(LD50)或最大耐受量(MTD)；通过长期毒性实验,考察因宁片对大鼠的长期毒性,观察因宁片口服灌胃后动物出现的毒性反应及蓄积中毒的症状和靶器官；对因宁片毒性反应的危害程度进行安全性评价,为拟开发因宁片成为抗甲亢新药而提供临床用药剂量的安全范围；对甲亢性肝损害的临床因素进行分析,为甲亢性肝损害的诊治提供依据。方法1.因宁片的急性毒性实验40只KM小鼠按编号及体重分层数字随机分为2组,即空白对照组、因宁片组(32g·kg-1),每组20只,雌雄各半,24h内2次灌胃给予纯净水及因宁片药液,2次给药间隔为6h。给药间隔期间连续观察小鼠的反应,之后每天上下午各观察1次,给药后连续观察14d,每天记录动物的一般状况,包括外观、行为、分泌物、排泄物、死亡情况及中毒反应(中毒反应的症状、严重程度、起始时间、持续时间、是否可逆)等,并记录体重和摄食量,实验结束后大体解剖小鼠,肉眼观察各脏器的病变情况。2.因宁片的长期毒性实验将48只SD大鼠按长期毒性实验分组方法随机分为4组,即空白对照组、因宁片低剂量组(0.6g·kg-1)、中剂量组(3g-kg-1)、高剂量组(6g·kg-1),每组12只,雌雄各半,各给药组分别相当于临床人日用剂量(0.06g·kg-1)的10倍、50倍和100倍；空白对照组给予等体积的纯净水。连续灌胃30d,给药期间大鼠自由摄食和饮水。每天观察记录大鼠的一般状况如进食、行为活动、粪便等。每周称体重和摄食量,并根据体重变化及时调整给药剂量。第30d给药24h后,用3%戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠,腹主动脉采血,采集的血样于血细胞分析仪上检测红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)、淋巴细胞(LY)等血液学指标。另外取血分离血清,于生化自动分析仪上测定血清中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、胆红素(BIL)、总蛋白(TP)等生化学指标。并对主要脏器进行全面尸检,取脑、心、肝、脾、肺、肾等脏器称重,计算脏器系数。并对上述主要脏器及胃、小肠、子宫、脑等用10%甲醛固定,进行常规病理学检查。3.甲亢性肝损害的临床因素分析回顾性分析我院2008年至2010年期间的甲亢病例,根据甲亢性肝损害的诊断标准,将甲亢患者分为单纯性甲亢组和甲亢性肝损害组,甲亢性肝损害的诊断标准为：具备以下四项者,甲亢性肝损害成立：(1)根据典型的临床症状、体征及甲状腺功能检查以明确甲亢诊断。(2)肝功能检查具备下列一项或以上者：①ALT及AST升高；②碱性磷酸酶(AKP)升高；③γ-转肽酶(γ-GT)升高；④总胆红素(TB)或(和)直接胆红素(DB)升高；⑤TP或(和)白蛋白(ALB)下降；⑥肝肿大。(3)排除其他原因所致的肝功能损害及肝肿大。(4)甲亢控制后,肝功能及肝肿大恢复正常。对两组患者的年龄、性别、病程、肝功能及甲状腺激素水平进行测定,从而对甲亢性肝损害的临床因素进行分析。结果1.因宁片对小鼠的急性毒性给药间隔期间和14d观察期内,各组小鼠精神和自主行为活动状况良好、皮肤被毛清洁、大小便正常,亦未见其他毒性反应症状。根据因宁片混悬液的最大浓度(0.4g·mL-1)和小鼠的最大灌胃体积(40mL·kg-1),得出MTD为32g.kg-1,相当于临床人日用剂量(0.06g·kg-1)的534倍。因宁片对小鼠的体重和摄食量均无影响。给药第14d结束24h后大体解剖小鼠,肉眼观察各脏器,心、肝、脾、肺、肾等均无异常。2.因宁片对大鼠的长期毒性给药期间,因宁片各剂量组大鼠的外观体征、行为活动、进食量及粪便等状况均正常,除一只大鼠死亡以外,其他的大鼠无一死亡。因宁片对大鼠的体重、摄食量、脏器系数均无影响。给药组的少数血液学指标和血液生化指标与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。第30d灌胃给药24h后,处死各组大鼠,肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等脏器,外形、体积、色泽均正常,无充血、肿胀、坏死等异常现象。各脏器用10%甲醛固定48h后,按常规方法做病理切片,光镜下观察,因宁片各剂量组大鼠的心、肝、脾、肺、肾等脏器与空白对照组比较,均未见异常。3.甲亢性肝损害的临床因素分析甲亢性肝损害的发生率为58.0%；甲亢性肝损害与性别无关(P=0.995)；甲亢性肝损害与年龄无关(P=0.994)；甲亢性肝损害组的ALT、AST、TB、DB、IB、球蛋白(G)显著高于单纯性甲亢组(P<0.05),而TP、ALB显著低于单纯性甲亢组(P<0.05),A/G差异无统计学意义(P>0.403)；甲亢性肝损害组的三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)显著高于单纯性甲亢组(P<0.05)。结论1.急性毒性实验：因宁片对小鼠的急性毒性较轻,对小鼠的外观体征、行为活动无影响。所以不能测出LD50,得出MTD为32g·kg-1。初步推断临床用药安全。2.长期毒性实验：因宁片(0.6g·kg-1、3g·kg-1、6g·kg-1)剂量组对大鼠灌胃给药30d的长期毒性实验观察所见：与空白对照组比较,因宁片各剂量组对受试大鼠的一般生理活动无影响,自主性行为、摄食量、体重增长等均正常；各重要脏器组织形态和组织病理切片镜检显示正常,未见有药物蓄积造成的明显毒性反应的靶器官存在；但血液学、血液生化的少数指标与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。3.甲亢性肝损害的临床因素分析：甲亢容易导致肝损害,与性别、年龄无关,与T3、T4等甲亢患者的病情密切相关。