【摘 要】
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目的:利用行为学、组织病理学、分子生物学等多种方法,探究人参皂苷Rb1（ginsenoside-Rb1,G-Rb1）对局灶性脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI）小鼠的Wnt信号通路上下游分子的调控机制。以深化目前G-Rb1对脑神经保护作用机制的研究,以期为临床利用G-Rb1对防治脑缺血再灌注损伤提供实验依据。方法:选取120只雄性C
【基金项目】
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国家自然基金委员会,地区基金项目（81660243）,Wnt/β-catenin信号通路在noggin基因转染NSCs移植脑缺血再灌注损伤中的调控机理（36.0万）； 贵州省科技厅,自然科学基金一般项目（黔科合基础-ZK[2021]一般415）,Noggin/VEGF双基因修饰NSCs移植治疗大鼠脑缺血再灌注损伤修复的分子机理研究（10.0万）；
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目的:利用行为学、组织病理学、分子生物学等多种方法,探究人参皂苷Rb1（ginsenoside-Rb1,G-Rb1）对局灶性脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI）小鼠的Wnt信号通路上下游分子的调控机制。以深化目前G-Rb1对脑神经保护作用机制的研究,以期为临床利用G-Rb1对防治脑缺血再灌注损伤提供实验依据。方法:选取120只雄性C57BL小鼠随机分为Sham组,CIRI组（cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI）、G-Rb1低剂量组、G-Rb1中剂量组、G-Rb1高剂量组和尼莫地平组,每组20只。采用改良线栓法制作右侧大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型,Sham组采用同样手术方式,但不阻塞血管。G-Rb1低剂量组、G-Rb1中剂量组、G-Rb1高剂量组在再灌注前10min分别腹腔注射G-Rb1（20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg）,Sham组和I/R组腹腔注射等量体积生理盐水。尼莫地平组同样于再灌注前10min给予腹腔注射尼莫地平（1mg/kg）。取材前行Y型迷宫检测小鼠学习记忆能力;平衡木实验检测小鼠运动能力;再灌注24h后处死小鼠,然后TTC（triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色测定脑梗死体积;Nissl染色观察海马CA3区存活神经元数量和形态变化;比色法测定缺血侧脑组织超氧化物歧化酶（Superoxide desmutase,SOD）活性、丙二醛（Maleic dialdehyde,MDA）含量;免疫组化染色观察海马CA3区GSK-3β、Wnt3a、wnt1、β-catenin蛋白阳性表达;Western-Blot检测GSK-3β、Wnt3a、wnt1、β-catenin蛋白表达变化并进行定量分析。q RT-PCR测定Wnt信号通路相关蛋白LRP-5、Axin2、β-catenin含量的变化。结果:1.神经功能评分结果:与sham组相比,CIRI模型组小鼠神经功能评分显著增加（P＜0.05）;与CIRI模型组相比,人参皂苷Rb1干预后神经功能评分明显降低,并且随着剂量的增加呈下降的趋势。2.平衡木和Y型迷宫检测结果:与sham组相比,CIRI组小鼠平衡能力、学习记忆能力均下降;与CIRI模型组相比,人参皂苷Rb1组和尼莫地平组小鼠平衡及学习记忆能力均提高。3.TTC染色结果:与sham组相比,CIRI模型组皮质可见明显白色梗死区;与CIRI模型组相比,人参皂苷Rb1组小鼠脑梗死体积明显降低,并随着剂量的增加,梗死体积减小。4.Nissl染色结果:sham组小鼠海马CA3区神经元结构未见异常;与sham相比,CIRI模型组海马CA3区损伤严重;与CIRI组相比,人参皂苷低剂量组神经元细胞损伤严重,无明显变化;人参皂苷Rb1中剂量组神经元细胞数量增加,细胞形态部分恢复,染色部分恢复;人参皂苷Rb1高剂量组细胞数量形态明显恢复,尼氏体数量明显增多。5.SOD、MDA检测结果:与sham组比较,CIRI模型组SOD活性显著降低,MDA含量明显增高;人参皂苷Rb1处理后,中剂量与高剂量组SOD活性增高,MDA含量降低。6.免疫组化染色结果:与sham组相比,CIRI模型组小鼠海马CA3区GSK-3β蛋白阳性细胞表达明显升高,而Wnt3a、Wnt1、β-catenin蛋白阳性细胞表达降低;与CIRI模型组相比,人参皂苷干预组GSK-3β蛋白阳性细胞表达随剂量的增加而增高,而Wnt3a、Wnt1、β-catenin、GSK-3β蛋白阳性细胞表达随剂量的增加而降低。7.Western-Blot检测结果:与sham组相比,CIRI模型组GSK-3β蛋白表达升高,而wnt3a、wnt1和β-catenin蛋白表达量降低;与模型组相比,人参皂苷Rb1干预各组GSK-3β蛋白表达量降低,而wnt3a、wnt1和β-catenin蛋白表达量升高,并且随着剂量的增加,作用越显著。8.q-PCR检测结果:与sham组相比,CIRI模型组Axin2和LRP5的m RNA表达量显著上升,而β-catenin的m RNA表达量显著降低;人参皂苷Rb1处理后,与模型组相比,海马组织中Axin2和LRP5的m RNA表达量显著降低,随着剂量的增加,表达量下降,而β-catenin的m RNA表达量随剂量的增加呈上升趋势。结论:1.人参皂苷Rb1对小鼠脑缺血再灌注损伤小鼠的神经功能与学习认知能力有改善作用;2.人参皂苷Rb1对小鼠脑缺血再灌注损伤小鼠的氧化应激损伤有抑制作用,还能减少小鼠的脑梗死体积;3.人参皂苷Rb1能改变脑缺血再灌注损伤小鼠wnt/β-catenin信号通路中上下游分子,即wnt1、wnt3a、β-catenin的表达上调,而GSK-3β、Axin、LRP-5的表达下调;据此推论,人参皂苷Rb1的神经保护作用机理可能与wnt/β-catenin信号通路的激活有关。
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