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目的:研究RA对脐血干细胞向神经元样细胞定向诱导分化的影响,探讨脐血干细胞向神经元样细胞分化的条件.,从而为研究脐血干细胞移植修复脊髓损伤提供实验基础。 方法:用密度梯度离心法从脐血中无菌分离单个核细胞(MNCs)置于含20%胎牛血清的DMEM培养液中培养,并在相同条件下扩增、传代,然后取体外扩增5代的脐血MSCs,接种于6孔培养板内,在培养液中加入10ng/ml的bFGF,在37℃,5%CO2条件下进行预诱导24h,然后吸去预诱导液,PBS洗涤3遍,加入含20%FBS的H-DMEM和20g/L的DMSO。在此基础上加入不同浓度的RA作为诱导剂进行诱导,并根据诱导剂浓度的不同和诱导时间的不同分组,静置培养观察细胞的形态学和组织学变化。分别于诱导24h、48h和72h后取细胞进行免疫组化检测神经元烯醇化酶(NSE),神经丝蛋白(NF-M)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)然后光镜下随机数取10个非重叠视野(×100),计算阳性细胞占总细胞数的比例结果用((?)±s)%表示,探讨RA在不同时间点对脐血干细胞向神经元样细胞分化的影响。然后于诱导72h后分别取含1μmol/L、3μmol/L、5μmol/L RA的各组细胞进行免疫组化检测NSE、NF-M、GFAP的表达,光镜下随机数取10个非重叠视野(×100),计算阳性细胞占总细胞数的比例,结果用((?)±s)%表示,探讨不同浓度的RA对脐血干细胞分化为神经元样细胞的影响。 结果:hMSC分离后体外培养约5d呈梭形变,培养15d~18d细胞达到80%~90%融合。(1)光镜下观察MSC诱导为神经元的形态变化:hMSC在预诱导液中处理24h后,梭形的脐血MSC胞体已发生收缩,细胞体积减小,部分胞体收缩成锥形或球形,细胞边缘变得不规整。正式诱导后,胞体进一步收缩,形成圆形、不规则的锥形、三角形,有的细胞有多个突起,而且发出分支,有的突起