去甲斑蝥素对人肝癌细胞株BEL-7402和人正常肝细胞株L-02增殖和凋亡的作用及其分子机理的探讨

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去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)是斑螯素的去甲基衍生物,目前作为抗肿瘤药物被广泛应用。临床应用NCTD治疗多种消化道肿瘤,主要以治疗原发性人肝癌,胃癌,食道癌,贲门癌等。 我们以人肝癌细胞株BEL-7402和人正常肝细胞株L-02为模型,用不同剂量NCTD(2、4、6、8和10μg/mL)分别处理两种细胞,生长曲线表明:NCTD对两种细胞的生长抑制作用存在明显的时间和剂量依赖性,随着药物作用时间的延长和药物浓度的增加,细胞生长受抑制,细胞倍增时间延长,并且药物对BEL-7402细胞的生长抑制作用较L-02细胞显著(p<0.05)。 形态学方面,选取作用差异较大的三个剂量(4、6、8μg/mL)分别处理两种细胞24hr,48hr和72hr。Hoechst33342和PI双染观察到出现染色质核凝集现象,随着药物剂量增大和作用时间的延长,核凝集数目逐渐增多,此外还出现凋亡小体的典型结构。 用流式细胞术和Giemsa染色研究显示,用6μg/mLNCTD作用人肝癌BEL-7402细胞和人正常肝L-02细胞24h和48h后,可引起细胞G2+M期周期阻抑和凋亡现象,随着NCTD药物剂量和作用时间增加,G2+M期阻抑现象越来越明显,凋亡率也逐渐升高;Giemsa染色结果显示,两种细胞均出现M期阻抑,出现细胞核染色质凝集现象并且有多核化现象。 NCTD作用后,细胞中产生大量多中心体和多极纺锤体现象,间接免疫荧光实验显示,6μg/mLNCTD处理人肝癌BEL-7402细胞和人正常肝L-02细胞48h,与对照相比,人肝癌BEL-7402细胞和人正常肝L-02细胞中均出现多极有丝分裂纺锤体现象,表明药物作用产生的周期阻抑和凋亡现象可能与多极纺锤体产生和中心体复制异常有关,蛋白免疫印迹结果显示,6μg/mLNCTD作48h后,中心体相关蛋白CrpF46表达水平在两种细胞中均有下调,INMAP在人肝癌BEL-7402细胞中下调更为显著,提示NCTD作用下,中心体相关蛋白CrpF46和INMAP可能在中心体复制异常和纺锤体组装异常中发挥作用。 进一步利用蛋白免疫印迹技术分析研究NCTD作用于人肝癌BEL-7402细胞和人正常肝L-02细胞增殖和凋亡的的分子机理,对细胞周期调控相关因子和凋亡相关蛋白的表达水平进行检测。结果显示,BEL-7402细胞中,与不加药的空白对照组细胞相比,6μg/mLNCTD处理48h后,p-Cdc2、p27、ATM、Chkl(Ser345)、Chk2(Thr68)和P53蛋白表达明显下调,CyclinB1蛋白水平变化不大,Cdc25C水平则被上调;在L-02细胞中,与不加药的空白对照组细胞相比,6μg/mLNCTD处理48h的p-Cdc2和p27蛋白水平下降,ATM、Chkl(Ser345)、Chk2(Thr68)和P53水平略有下降,CyclinB1和Cdc25C蛋白水平上调,提示NCTD可能通过影响引擎分子的活性和作用于ATM/Chk1/Chk2信号通路影响周期调控。运用上述相同剂量与给药时间处理BEL-7402和L-02细胞,与不加药对照组相比,加药组的前体caspase3表达水平均下降,提示具有活性的caspase3水平上升,但未检测到Bax、Bcl-2和Fas表达水平的明显变化。药物处理后,procaspase3在BEL-7402细胞下调比L-02细胞更为明显。实验结果表明,经6μg/mLNCTD处理48h后,均能诱导BEL-7402细胞和L-02细胞凋亡,其作用的分子机理可能与激活caspase3密切相关。 此外对增殖和凋亡相关通路MAPK信号通路、NF-κB信号通路和PI3K-PKB/Akt通路中相关因子的表达水平进行检测,结果显示,三条通路均参与作用,与不加药对照组相比,加药处理的BEL-7402细胞和L-02细胞中,JNK1、p-Erk1/2、IKKβ、p-IκB-α和p-PTEN蛋白表达水平均不同程度下降,p-MEK3/6和PTEN水平均上调。 实验表明,6μg/mLNCTD作用引起的抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的反应,在人肝癌BEL-7402细胞和人正常肝L-02细胞存在一定差异,人肝癌BEL-7402细胞对NCTD作用更为敏感,特别是周期调控相关因子p-Cdc2、Chk1(Ser345)、Chk2(Thr68)和P53以及凋亡相关因子procaspase3对去甲斑蝥素作用后在人肝癌BEL-7402中水平下调幅度比在人正常肝L-02细胞明显。
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