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研究背景和目的:一氧化碳(CO)是急性中毒导致死亡最常见的窒息性气体,是较常见的职业性及生活性中毒,能引起以中枢神经系统和心血管系统功能损害为主的多脏器损害。其中最严重的是部分患者急性中毒症状消失后,经过数天或数周表现正常或接近正常的假愈期,会出现以痴呆为主的精神神经症状称为急性一氧化碳中毒迟发性脑病( delayde encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning, DEACMP),其发病机制迄今尚未阐明,治疗也无特效方法,一直是困扰临床领域的棘手难题,给社会家庭造成极大负担。Nogo-A蛋白是由Nogo基因编码的蛋白,Nogo-A有抑制成熟中枢神经系统神经元轴突再生作用,是目前认为抑制中枢神经系统再生的关键物质之一。Nogo-A已被证明为NI-250,在中枢神经系统的少突胶质细胞表达,外周神经系统Schwann细胞不表达。Nogo-A是在中枢神经系统髓磷脂中发现的一种抑制轴突生长的蛋白,它含有两个完全独立的具有抑制活性的结构域:位于细胞内的amino-Nogo和位于细胞表面的Nogo-66。Nogo-66是通过与其受体复合体NgR/p75/Lingo-1结合发挥作用的。已证实Nogo-A是通过这三个截然不同的区域来触发神经轴突抑制、生长锥崩溃、阻止纤维原细胞散布,这些都使得Nogo-A成为限制神经再生和轴突损伤修复的一个关键因素。鉴于Nogo-A蛋白及其受体系统的解剖及病理生理特点,而DEACMP患者颅脑影像学上白质脱髓鞘突出,因此我们推测Nogo-A蛋白及其受体系统与急性CO中毒尤其与DEACMP关系密切。本实验中我们采用外源性CO直接处理体外培养的少突胶质细胞,排除缺氧影响,观察少突胶质细胞Nogo-A在蛋白质及mRNA水平表达的影响,为研究急性CO中毒及DEACMP的具体机制提供新的实验线索,为临床防治带来新的机会和希望。神经节苷脂是一种含唾液酸的糖神经鞘脂类物质,是人类细胞膜的组成成份,在中枢神经系统中含量尤其丰富。通常根据唾液酸数目的不同分为GM(单唾液酸神经节苷脂)GD(二唾液酸神经节苷脂)和GT(三唾液酸神经节苷脂)等。又根据糖基数目不同将GM分为GM1(含4个糖基)、GM2(含3个糖基)、GM3(含2个糖基)。神经节苷脂具有丰富的生物学功能,如维持细胞膜结构的稳定;作为细胞标记和抗原,参与细胞细胞间相互作用和识别;作为分化标志,参与细胞生长调节和信息传递;作为某些生物活性物质的受体,影响细胞质膜蛋白的功能及参与细胞粘附等。大量实验研究结果表明,神经节苷质类物质能调节与神经元膜有关的神经功能,特别是对神经组织分化成熟和神经组织损伤后有明显促进作用;其中单唾液酸四已糖神经节苷脂(GM1)对神经元有明显的保护作用。GM1是最重要的神经节苷脂之一,在中枢神经系统病变的治疗中起重要作用,在神经发生,生长及分化中起必不可少的作用。外源性GM1可能过血脑屏障进入中枢神经系统并整合到神经细胞膜发挥作用。GM1对中枢神经系统损伤具有明显的修复作用。GM1对CO中毒所致的少突胶质细胞损害是否有保护作用,其作用是否与少突胶质细胞上Nogo-A蛋白有关目前尚无报道,本实验拟在细胞水平对此加以探讨。方法:(1)取新生2天SD大鼠的视神经,采用组织块培养法,用DMEM/F12化学限定培养液培养、纯化少突胶质细胞。细胞免疫化学检测少突胶质细胞髓鞘碱性蛋白(Myelin basic protein,MBP)表达,鉴定少突胶质细胞,并计算阳性率。(2)在排除缺氧的影响下,1%CO处理少突胶质细胞,采用RT-PCR及细胞免疫组化观察6h、24h、48h少突胶质细胞Nogo-A mRNA及其蛋白表达。(3)在培养液中预先加入GM1,1%CO处理少突胶质细胞,检测Nogo-A mRNA及其蛋白的表达。结果:1、组织块24h开始贴壁,48h-72h可见神经组织边缘游出少量细胞,主要为椭圆形和梭形,有一细长突起。延缓7～9天细胞增长迅速,9～10天左右细胞基本从组织块中游离出来,平铺于皿底。11天左右获得的细胞胞体基本为呈圆形或多角形,突起细长,胞核呈椭圆形,直径约6-10um,细胞核较大,胞质少,细胞计数每孔为(6～8)×104。细胞免疫化学染色MBP蛋白阳性,95%以上为阳性细胞。2、RT-PCR检测Nogo-A mRNA表达:对照组的表达6小时开始上升、24小时达高峰、48小时后表达逐渐下降;CO组的表达同比明显高于对照组(P<0.01)有统计学差异;GM1组的表达接近于对照组(P<0.01)有统计学差异。3、细胞免疫化学检测Nogo-A蛋白表达:免疫细胞化学染色图像分析结果显示:对照组6小时、24小时、48小时均有Nogo-A蛋白的表达,但未见其表达随时间发生明显变化;CO组各时间点累计光密度值明显高于对照组(P<0.05)有统计学差异;GM1干预后累计光密度值下降接近对照组(P<0.05)有统计学差异。结论:(1)新生大鼠视神经少突胶质细胞体外培养技术稳定,可获得实验所需足量细胞。(2)外源性CO诱导体外培养少突胶质细胞Nogo-A mRNA及蛋白表达增加。(3)外源性CO诱导体外培养少突胶质细胞Nogo-A mRNA表达增加时,应用GM1对Nogo-A mRNA及蛋白的表达有明显抑制作用。