视网膜色素变性(Retina pigmentosa,RP)是一种遗传性视网膜退行性病变,以光感受器细胞死亡为主要病理特征的严重的致盲眼病,临床上缺乏有效的治疗方法。皇家外科学院(Royal college of surgeons,RCS)大鼠为酪氨酸激酶mertk受体基因突变引起的常染色体隐性遗传病变鼠。病变引起自发性的视网膜色素上皮细胞(RPE)吞噬功能障碍,导致光感受器细胞外节堆积,从而继发引起光感受器细胞死亡,并累及内核层1。该病变过程与人类遗传性视网膜色素变性疾病的发病过程极为相似,因此RCS大鼠是研究此类疾病的良好动物模型。视网膜Müller细胞是脊柱动物视网膜内一种主要的胶质细胞2。目前研究认为Müller细胞特殊的放射状结构贯穿视网膜全层,对维持视网膜解剖学及功能学的稳定有着重要作用,同时它参与到多种视网膜代谢及功能活动中,在视网膜的各种病理条件下,Müller细胞发生活化,表现在其细胞数量,形态以及蛋白表达上均会出现一系列变化2。同时,成熟的Müller细胞还具有一定的逆分化潜能。Müller细胞参与了视网膜内谷氨酸以及γ-氨基丁酸等兴奋性神经递质的摄取与代谢。所以Müller细胞表达了较高的谷氨酰胺合成酶(GS)活性。在视网膜功能上,Müller细胞作为内层视网膜的重要细胞,参与了视网膜电图ERG中,b波成分的组成3。因而这两项指标通常作为了研究视网膜Müller细胞功能的主要指标。α-aminoadipic acid (AAA)是一种选择性胶质毒性药物4,既往研究观察到,它可以通过竞争性抑制中枢神经系统及视网膜内谷氨酰胺合成酶活性而达到抑制其谷氨酸代谢功能的作用5-6。在体研究中观察到,该种药物可以使视网膜Müller细胞重要的功能蛋白谷氨酰胺合成酶表达下降,并引起视网膜电图(Electroretinogram,ERG)发生可逆性变化7。而该视网膜GS表达下降与视网膜电图是否存在对应关系,目前尚未见此类报道。本实验室以往研究表明RCS鼠在变性过程中,Müller细胞最终到达视网膜下腔形成胶质封闭的作用,阻断视网膜神经上皮与色素上皮之间的联系,导致感光细胞加速死亡。如果利用药物,使Müller细胞功能选择性失活后,其病变过程中会出现怎样的变化呢?亦未见文献报道。因此,我们假设:α-aminoadipic acid (AAA)特异性地使大鼠视网膜Müller细胞功能失活,可以导致视网膜GS表达与ERG b波改变,并延缓视网膜色素变性病变的进展。针对上述假设,进行如下研究:1.利用药物(α-aminoadipic acid )建立大鼠视网膜Müller细胞特异性功能失活模型。2.从生物学和电生理上观察Müller细胞功能失活后,正常大鼠视网膜各层细胞的形态学变化,以及视网膜电图b波的改变。3.从生物学和电生理上观察Müller细胞功能失活后,RCS大鼠视网膜各层细胞的形态学变化,以及视网膜电图b波的改变。本研究主要结果如下:1.正常大鼠视网膜Müller细胞特异性功能失活模型的建立及鉴定:应用组织化学方法观察正常大鼠视网膜下腔注射选择性胶质毒性药物AAA以后,视网膜Müller细胞重要功能蛋白GS的表达活性改变:结果发现,AAA组在注射后第5天开始出现GS表达下降,于第7天时达到高峰,于第10天开始恢复;而视网膜Müller细胞表面标记物vimentin,双极细胞表面标记物PKCα,光感受器细胞表面标记物recoverin在AAA组及PBS组表达无差异。提示该模型中Müller细胞失活为功能性可逆性改变。2.正常大鼠视网膜Müller细胞特异性功能失活模型的生物学及ERG研究:应用组织化学方法和闪光视网膜电图方法,观察正常大鼠视网膜Müller细胞功能失活以后,视网膜Müller细胞GS表达变化以及视网膜电图ERG功能变化。结果发现,(1)正常大鼠视网膜Müller细胞功能失活后第7天,视网膜Müller细胞GS表达下降;在视网膜ERGb波出现振幅下降,损失的部分波形与Müller细胞功能活性密切相关。(2)第30天Müller细胞GS表达及视网膜ERGb波振幅均恢复至给药前水平。(3)正常大鼠视网膜Müller细胞功能失活后视网膜Müller细胞失活率K0与视网膜ERGb波振幅下降率V0显著正相关。3. RCS大鼠视网膜Müller细胞特异性功能失活模型的生物学及ERG研究:(1)应用闪光视网膜电图记录方法,记录RCS大鼠发育过程中视网膜电图ERGa、b波振幅变化;(2)应用闪光视网膜电图记录方法及免疫组织化学方法观察在RCS大鼠正常大鼠视网膜Müller细胞功能失活后,Müller细胞特异性功能的生物学及ERG改变。发现:1)RCS大鼠在P21d时较对照组大鼠已经出现a,b波振幅的下降,同时潜时明显延长,以a波改变为主;随着病变的发展,ERGa,b波振幅进一步下降,潜时延长;至P60d时,RCS大鼠ERG反应呈熄灭型。2)在RCS大鼠视网膜色素变性中期(P30d)建立视网膜Müller细胞功能失活模型,在失活第30天(P60d)时,注射区局部可观察AAA组视网膜Müller细胞增殖及外核层变薄趋势较PBS组延缓,但功能改善不显著;在失活30(P60d)d时,AAA组,PBS组,空白组大鼠均无法检测到ERG波形。3)对RCS大鼠病变早期(P16d)建立视网膜Müller功能失活模型,于失活后第45天可观察到视网膜Müller细胞增殖及外核层变薄趋势较PBS组显著延缓;于失活后第15d,30d视网膜a,b波振幅均比PBS组及同天龄空白组显著提高,且潜时提前;于失活后第45d时,AAA组,PBS组,空白组大鼠均无法检测到ERG波形。综上所述,本课题得出如下结论:1.利用选择性胶质毒性药物AAA使正常大鼠视网膜Müller细胞功能失活后第7天,视网膜Müller细胞GS表达下降,光感受器细胞及双极细胞未见明显异常,在视网膜ERGb波在各刺激光强均出现振幅下降,损失的部分波形与Müller细胞功能活性密切相关,于第30天Müller细胞GS表达及视网膜ERGb波振幅均恢复至术前。表明采用选择性胶质毒性药物AAA可以建立可逆的大鼠视网膜Müller细胞特异性功能失活模型,该模型中视网膜ERGb波改变与视网膜Müller细胞GS表达改变呈正相关。2. RCS大鼠在P21d时较对照组大鼠已经出现a,b波振幅的下降,同时潜时明显延长,以a波改变为主。随着病变的发展,ERGa,b波振幅进一步下降,潜时延长,至P60d时,RCS大鼠ERG反应呈熄灭型。表明RCS大鼠睁眼后视网膜感光细胞已开始变性,P60d时感光细胞功能基本消失。3. RCS大鼠病变早期(P16d)Müller细胞功能失活后,可以显著延缓视网膜Müller细胞增殖及外核层变薄趋势,在术后早期显著改善视网膜功能。病变中期(P30d)Müller功能失活后,在注射区局部可观察视网膜Müller细胞增殖及外核层变薄趋势较对照组延缓,但ERG功能改善不显著;在术后30d(P60d)时,各组大鼠均无法检测到ERG波形。然而,结果既验证了我们的假设:α-aminoadipic acid (AAA)特异性地使大鼠视网膜Müller细胞功能失活,可以导致视网膜GS表达与ERG b波改变,并延缓视网膜色素变性病变的进展;又表明到了视网膜色素变性中晚期Müller细胞功能失活亦不能延缓病情发展。