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第一部分机械敏感性离子通道蛋白Piezo在骨折愈合中的表达模式目的:探究参与骨折修复的细胞类型以及Piezo蛋白在各类细胞及骨痂组织中的表达模式。方法:收集不同愈合时期的小鼠骨痂组织样本,利用10×单细胞测序技术检测其中的细胞类型,并分析Piezo基因在各细胞中的表达情况。通过收集临床样本和小鼠骨痂组织,对组织样本进行RT-PCR、Western blot及免疫组化分析,研究Piezo蛋白在骨痂组织中的表达模式。结果:单细胞分析显示,小鼠骨痂组织中包含15个细胞亚群,包括:骨外膜干细胞、间充质干细胞、成骨细胞、软骨细胞、破骨细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞以及大量免疫细胞（中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、树突状细胞、T细胞、NK细胞和B细胞）。在骨折后10天的骨痂组织中,含有较大比例的骨外膜干细胞（14.7%）、软骨细胞（5.4%）和成骨细胞（5.4%）。在骨折后20天的骨痂组织中,存在大量的免疫细胞。Piezo1在干细胞、成骨谱系细胞、软骨细胞和内皮细胞中高表达。而Piezo2仅在软骨细胞中表达。通过RNA速率分析和Monocle2进行拟时序分析,发现骨外膜干细胞位于发育的起点,是成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞的祖细胞。有趣的是,Piezo1基因主要在细胞发育轨迹的开始和中间高表达,而Piezo2只在发育轨迹的中间表达水平升高。在人的骨痂组织中,Piezo1的表达水平高于正常骨组织。在小鼠骨折发生后,Piezo1的表达水平增加,在骨折后第14天达到峰值,随后,在骨折后第21天和第28天表达下降。对骨折后10天的骨痂组织进行免疫组化分析发现,在所有的骨痂区域都可以检测到Piezo1阳性细胞,包括软骨性骨痂和膜内骨形成区。而仅在软骨骨痂内检测到Piezo2阳性细胞。结论:骨外膜干细胞是参与骨折修复的主要细胞来源,Piezo1在骨折愈合过程中表达增加,并可以作为骨折修复过程中关键的力学感受器。第二部分机械敏感性离子通道蛋白Piezo1介导骨外膜干细胞的力学信号转导参与骨折愈合的调节目的:探究机械敏感性离子通道蛋白Piezo1在介导骨外膜干细胞力学信号转导调节骨折愈合中作用及相关机制。方法:通过Piezo1 shRNA下调Piezo1在骨痂组织中的表达。使用Piezo1特异性激动剂Yoda1行小鼠腹腔注射,观察其对骨折愈合的影响。体外分离培养骨外膜干细胞,结合Piezo1 shRNA和YAP抑制剂,研究激活Piezo1对骨外膜干细胞的迁移及分化的影响,并进一步探究其相关机制。YAP抑制剂行小鼠腹腔注射,研究其在Piezo1激活中的作用。结果:在骨痂组织中,下调Piezo1的表达延迟骨折愈合。在体内,使用Yoda1激活Piezo1促进骨痂形成及改建,加速骨折愈合。在体内外,Yoda1促进骨外膜干细胞的迁移、成骨分化及成软骨分化。此外,Yoda1可以促进骨外膜干细胞分泌VEGFA间接促进血管的生成。激活Piezo1促进骨外膜干细胞YAP的表达及向核内的移位,进而增加了β-catenin的表达和向核内移位。并且,YAP可以在细胞核中与β-catenin相互作用,形成转录YAP/β-catenin复合物,上调成骨、成软骨和血管生成因子。在体内和体外,Piezo1激活后的生物学效应,可以被YAP抑制剂阻断。结论:Piezo1在骨折愈合中发挥重要的作用。在骨外膜干细胞,激活Piezo1可以通过YAP/β-catenin通路促进其迁移及分化,并间接促进血管的生成。Piezo1可以作为骨折治疗的有效靶点。第三部分机械敏感性离子通道蛋白Piezo1在延迟性骨折愈合中的作用目的:评估Piezo1特异性激动剂Yoda1对机械卸载导致骨折延迟愈合的治疗作用及相关机制。方法:利用小鼠鼠尾悬吊模拟下肢机械卸载状态,使用Yoda1进行腹腔注射,观察对骨折愈合的改善作用;使用Gli1-CreER;tdTomato小鼠,研究Yoda1对骨外膜干细胞迁移及分化的影响;通过免疫组织化学标记OCN和Emcn,观察Yoda1治疗对成骨及血管生成的改善作用;Western blot检测在不同状态下,Piezo1蛋白的表达变化。结果:与落地组相比,鼠尾悬吊组骨痂组织体积（TV）、骨体积（BV）、BV/TV和骨密度（BMD）均明显降低。Yoda1增强了鼠尾悬吊状态下矿化骨的形成,骨痂组织中具有更高的BV、BV/TV和BMD。鼠尾悬吊组小鼠在骨折14天时显示,骨痂组织中Td阳性细胞、OCN阳性细胞和血管数量明显减少。与悬吊组对比,Yoda1治疗组小鼠骨痂中具有更多的Td阳性细胞、OCN阳性细胞和血管数量。此外,在鼠尾悬吊20天后,骨痂组织中Piezo1蛋白的表达水平显著降低。而Yoda1治疗可以维持Piezo1蛋白的表达水平。结论:Piezo1在骨折愈合过程中是介导力学转导的重要力学感受器。激活Piezo1能改善由于机械卸载导致的骨折延迟愈合。因此,Piezo1可以作为预防或治疗机械卸载引起的骨折延迟愈合或不愈合的有效靶点。