复合发酵乳改善便秘小鼠的作用及其机制研究

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背景和目的便秘(constipation)是一种世界范围内普遍流行的功能性胃肠道疾病,其患病率目前高达15-20%。随着现代生活节奏加快,不良的生活方式、心理亚健康状态日益增加,导致罹患该病成为一种普遍现象。便秘不仅严重影响患者的生活质量,还会诱发心脑血管疾病并导致结直肠癌的发病风险增加,便秘已成为当下亟待解决的健康问题。目前用于治疗便秘的药物种类繁多,如刺激性泻剂、润滑性泻剂等,但这些药物在长期使用时往往产生药物依赖,也会带来如胃肠胀气、水电解质失衡、结肠黑变病等不同程度的副作用。因此,发现一种更加安全有效的防治手段具有重要的临床意义及社会意义。便秘与肠道菌群联系紧密,便秘患者常存在肠道菌群失衡,近年来微生态调节剂广泛应用于消化系统疾病的治疗中,并取得了较好的临床疗效。既往的研究表明,食用富含保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的发酵乳能增加小鼠肠道中丙酸、丁酸的含量,乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌及鼠李糖乳杆菌也被证实具有抗炎、增强肠道乙酸水平及增强肠黏膜屏障功能的作用。但包含保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的复合发酵乳制剂治疗便秘的效果及具体机制目前尚未明确。因此,本研究通过洛哌丁胺构建小鼠便秘模型,探究该复合发酵乳制剂对便秘小鼠的疗效并明确其对肠动力、肠黏膜屏障功能、肠道菌群及固有免疫的影响,以期为临床便秘的防治提供更为详实的理论依据和一种新的干预手段。实验方法C57BL/6JNifdc小鼠27只,随机平均分为对照组、模型组及干预组。模型组及干预组连续给予洛哌丁胺灌胃2周,从第2周开始,干预组给予洛哌丁胺灌胃后加灌复合发酵乳,连续治疗7d。对照组始终给予生理盐水灌胃。测定各组小鼠体重变化、粪便含水率、首粒黑便排出时间及小肠推进率。检测小鼠结肠五羟色胺2C受体(serotonin C receptor,5-HTR2C)、闭锁小带蛋白-1(zona occludins-1,ZO-1)、组织黏蛋白-2(mucin-2,MUC-2)、游离脂肪酸受体3(free fatty acid receptor 3,FFAR3)、色氨酸羟化酶1(tryptophan hydroxylase 1,TPH-1)、游离脂肪酸受体2(free fatty acid receptor 2,FFAR2)、白介素-22(interleukin 22,IL-22)、白介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)、半胱肽氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate-specific proteinase-1,caspase-1)m RNA的表达量;Western blot检测Raf/ERK/MAPK通路相关蛋白;靶向代谢组学分析检测肠道短链脂肪酸(short chain fatty acid,SCFA)乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸、异己酸水平;16S r DNA高通量测序分析肠道菌群变化。结果1.经7天洛哌丁胺干预,小鼠粪便质地坚硬、表面干燥,粪便含水率显著降低及首粒黑便排出时间显著延长(P<0.01,P<0.01),提示便秘模型制造成功。2.小鼠排便情况的改变:与对照组相比,模型组小鼠粪便含水率及小肠推进率显著降低(P<0.01,P<0.01),首粒黑便排出时间显著延长(P<0.01)。与模型组相比,干预组粪便含水率及小肠推进率显著增加(P<0.05,P<0.05),首粒黑便排出时间显著缩短(P<0.01)。3.结肠病理改变:模型组小鼠结肠组织上皮层部分缺失,固有层肠腺细胞萎缩、排列紊乱无序。经复合发酵乳干预,便秘小鼠结肠组织黏膜层形态趋于正常,上皮层连续,固有层肠腺细胞排列较为整齐。4.小鼠肠黏膜屏障相关指标的改变:与对照组相比,模型组小鼠结肠MUC-2、ZO-1 m RNA表达显著下调(P<0.05,P<0.01)。经复合发酵乳干预,MUC-2、ZO-1 m RNA表达增加,其中ZO-1 m RNA的差异具有统计学意义(P<0.05)。5.肠动力相关基因表达:与对照组相比,模型组小鼠5-HTR2C、FFAR3、TPH-1 m RNA表达水平显著降低(P<0.001,P<0.01,P<0.001),经复合发酵乳干预,5-HTR2C、FFAR3、TPH-1m RNA表达水平增加,其中5-HTR2C、TPH-1m RNA的增加具有统计学意义(P<0.001,P<0.001)。6.结肠Raf/ERK/MAPK通路蛋白检测:与对照组相比,模型组p-Raf、p-ERK1/2、Raf蛋白表达降低,且p-Raf蛋白的降低具有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比,治疗组小鼠结肠p-Raf、p-ERK1/2、Raf蛋白表达显著升高(P<0.01,P<0.05,P<0.05)。7.小鼠肠道SCFA靶向代谢组学分析:与对照组相比,模型组小鼠肠道SCFA水平显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05),复合发酵乳干预后,小鼠肠道乙酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸的水平显著增高(P<0.01,P<0.05,P<0.05,P<0.05,P<0.05)。8.肠道菌群16S r DNA高通量测序:与对照组相比,便秘小鼠肠道菌群多样性降低,与SCFA代谢相关的菌属丰度显著降低,经复合发酵乳干预,小鼠肠道菌群多样性增加,产SCFA的菌属如norank_f__Muribaculaceae、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Akkermansia等的丰度增加(P<0.05)。9.小鼠固有免疫相关基因的改变:与对照组相比,模型组小鼠结肠IL-22、IL-1β、FFAR2 m RNA表达显著降低,差异具有统计学意义(P<0.001,P<0.01,P<0.001)。经复合发酵乳干预,便秘小鼠结肠IL-22、IL-1β、FFAR2 m RNA表达均增加,其中IL-22 m RNA的差异具有统计学意义(P<0.05)。caspase-1 m RNA的表达无显著变化(P>0.05)。结论:复合发酵乳可通过调节肠道菌群靶向调控norank_f__Muribaculaceae、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Akkermansia等产SCFA细菌的丰度提高便秘小鼠肠道中SCFA含量,上调结肠FFAR3、TPH-1 m RNA表达并促进Raf/ERK/MAPK通路的磷酸化提高结肠5-HTR2C m RNA的表达量以促进肠道蠕动,同时通过上调结肠ZO-1m RNA表达增强肠黏膜屏障功能,并通过上调结肠IL-22 m RNA表达水平增强固有免疫应答,从而起到改善便秘的作用。
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