论文部分内容阅读
研究背景:脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是最常见的急性脑血管疾病之一。脑出血具有起病急骤,病情凶险,进展快,患者可在短时间内发生脑疝等严重并发症,致残率与致死率高等特点。脑出血后脑内血液迅速积聚到脑实质导致正常解剖结构的破坏和局部压力的增加,形成血肿及脑组织继发损伤,并产生一系列病理生理改变,包括血肿扩大压迫导致的局部脑血流灌注障碍、血肿周围水肿的形成、血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)的损伤及其通透性的改变等。同时,脑出血后导致脑组织缺血缺氧,造成脑组织中活性氧物质(Reactive oxygen species,ROS)的过量产生,进而引起神经细胞的氧化应激,使脑组织发生多种病理改变,如细胞凋亡、自噬、炎症反应和血脑屏障破坏等,从而导致脑组织的继发性损伤,严重损害神经功能。脑组织缺血缺氧引起缺氧诱导因子(Hypoxiainducible factor,HIF)的表达量上调,HIF的表达可以引起一系列下游基因的转录和表达,在脑出血后脑组织的继发性损伤过程中发挥重要作用。HIF及其下游的BNIP3通路在自噬和细胞凋亡方面具有重要调控作用,是脑出血后脑损伤过程的重要调控因子。醒脑静注射液来源于古验方“安宫牛黄丸”,是以天然麝香、冰片、栀子、郁金为主要成分的中药注射液,能够有效促进ICH病人颅内血肿吸收,减轻炎症反应和脑水肿,改善神经功能。但醒脑静发挥脑保护作用的机制还不清楚。本研究采用胶原酶诱导脑出血大鼠模型,结合病理、分子生物学等方法观察大鼠脑出血脑组织超微结构的改变及相应的病理变化,并检测出血周围脑组织中HIF、BBB相关蛋白、自噬相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达变化,探讨醒脑静减轻保护脑出血继发性损伤的机制。研究目的:1建立大鼠脑出血模型,造模后观察大鼠神经功能缺损情况,检测脑出血和脑水肿形成情况及醒脑静注射液对大鼠脑出血后脑组织的保护效果。2检测大鼠脑出血后脑组织中HIF、BBB相关蛋白、自噬相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达情况,并检测醒脑静注射液对上述蛋白表达的影响,探讨醒脑静注射液通过HIF-BNIP3通路调控自噬、细胞凋亡及血脑屏障通透性的途径和机制,为在“病络-毒损脑络”理论指导下中医药保护脑出血继发性损伤提供理论和实验依据。研究方法:1使用SPF级健康的雄性SD大鼠建立大鼠脑出血模型,将造模成功的大鼠随机分为模型组、醒脑静组和依达拉奉组,通过腹腔注射给药,采用mNSS神经功能评分法,观察大鼠脑出血后神经功能缺损情况。给药三天后,将各组大鼠断头取脑,分别通过HE染色、尼氏染色和透射电镜的方法,观察大鼠脑出血后脑组织病理结构和超微结构改变。2使用上述方法制备大鼠脑出血模型并进行随机分组,分别腹腔注射给药三天。三天后将各组大鼠断头取脑,制备病理切片,通过伊文思蓝(Evens blue,EB)法测定BBB通透性;通过免疫组化检测HIF,血脑屏障相关蛋白ZO-1、Occludin、AQP4、MMP9和自噬相关蛋白Beclin-1和BNIP3的表达情况。制备各组大鼠脑出血后脑组织提取物,通过Western blot检测HIF,血脑屏障相关蛋白ZO-1、Occludin、AQP4、VEGF,自噬相关蛋白Beclin-1、BNIP3、LC3,凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达情况。研究结果:1 mNSS神经功能评分发现,脑出血模型组大鼠的神经功能评分明显高于假手术组,神经功能明显缺损;与模型组相比,醒脑静组和依达拉奉组大鼠神经功能评分明显降低,神经功能缺损得到明显改善。2HE染色、尼氏染色和伊文思蓝染色的结果显示,与假手术组相比,脑出血模型组大鼠脑组织中血脑屏障通透性明显增加,脑水肿明显增加,神经细胞形态明显改变,损伤加重。透射电镜结果显示,脑出血模型组大鼠脑组织中神经元、星形胶质细胞和血管内皮细胞结构明显被破坏。与模型组相比,醒脑静组和依达拉奉组大鼠脑出血后脑组织血脑屏障通透性降低,脑水肿程度减小;神经元、星形胶质细胞和血管内皮细胞的结构明显改善。3免疫组化的结果显示,脑出血模型组大鼠脑组织中HIF、AQP4、MMP9、VEGF、Beclin-1和BNIP3的表达明显高于假手术组,而ZO-1和Occludin的表达则显著低于假手术组;而与模型组变比,醒脑静组和依达拉奉组大鼠脑出血后脑组织中HIF、AQP4、MMP9、VEGF、Beclin-1和BNIP3的表达明显降低,而ZO-1和Occludin的表达明显升高。4 Western blot的结果显示,与假手术组相比,脑出血模型组大鼠脑组织中HIF、AQP4、MMP9、VEGF、Beclin-1、BNIP3、LC3和Bax的表达明显升高,而ZO-1、Occludin和Bcl-2的表达量则明显降低。与模型组相比,醒脑静组和依达拉奉组大鼠脑出血后脑组织中HIF、AQP4、VEGF、Beclin-1、BNIP3、LC3和Bax的表达明显减少,而ZO-1、Occludin和Bcl-2的表达量则显著升高。结论:醒脑静注射液明显降低大鼠脑出血后的神经功能评分,减轻神经功能缺损,降低血脑屏障通透性,减轻神经细胞的损伤情况。醒脑静注射液明显降低大鼠脑出血后脑组织中HIF的表达,降低BNIP3的表达,减轻细胞凋亡和自噬,在脑出血后发挥神经保护作用。