一、miR-429通过RBBP4/E2F1/OCT4通路富集肝癌起始细胞的作用和机制研究　　（一）研究目的　　原发性肝癌是世界第五大常见恶性肿瘤，超过90％的原发性肝癌是肝细胞性肝癌（HCCs，简称肝癌）。我国是乙肝及肝癌高发区之一，其死亡率在恶性肿瘤中上升至第二位。但是，由于HCC早期在临床上无特征性表现，就诊时往往已是晚期，手术的根治性切除率很低，其预后通常很差，目前肝癌病人五年生存率尚不足50％，因此对于肝癌发生的分子机制的研究以及早期诊断就显得尤为重要。其中，肿瘤发生的关键可能在于肝癌起始细胞(TICs)，TICs是一类拥有自我更新功能，并且可以分化为具有不同异质性肿瘤细胞的细胞群体，目前的肿瘤干细胞理论支持TICs的存在。而研究肿瘤进展的关键表型是细胞增殖，转移和浸润。有上述生物学行为的肿瘤细胞获得了无线增殖和侵袭周围组织的能力，而调控这些生物学行为的遗传学以及表观遗传学上的改变可促进或抑制肿瘤的发生和发展。所以，加强人们对HCC发生发展过程中重要信号通路以及节点分子的认识，将极大促进HCC早期诊断或治疗手段的发展。业已有大量研究报道，在实验和临床肝癌发生过程中，均有不同类型的遗传学及表观遗传学改变。此外，在早期诊断HCC病人以及预测病人预后等方面，基因表达谱的应用具有较高的科研价值。　　课题组前期通过队列筛查，发现人血清中一组循环小RNA具有预测HBsAg阳性病人发生HCC风险的潜能，其联合诊断的特异性及敏感性可能优于AFP。其中，miR-429具有最好的预测特异性及敏感性，且肝癌起始细胞(T-ICs)来源的miR-429能直接靶向抑制抑癌基因视网膜母细胞瘤结合蛋白4（RBBP4），促进T-ICs的增殖、自我更新和化疗抵抗前期的研究结果提示miR-429可能是预测HCC发生新的监测指标和治疗靶点。这些研究为本课题确定miR-429是潜在的治疗干预靶点及其在肝癌起始过程中的作用机制奠定了基础。　　小RNA被美国著名杂志《Science》评为2002年十大科技突破的第一名。自参与调控线虫时序发育的lin-4与let-7被发现以来，至2011年底已有1527个前体和2154个成熟的miRNA在人类中被报道(From Sanger Lab，Release18，2011.11)。目前在不同物种中发现的成熟miRNA通常的长度约为22个核苷酸，其3端为羟基，5端有一个磷酸基团，没有开放阅读框架和蛋白质编码基因。　　MicroRNAs的生成和作用机制比较复杂，大部分的机制尚未明确，其特点主要表现为它的保守性、基因簇集现象和特异性表达。成熟的miRNA由miRNA前体(pre-miRNA)加工而成。miRNA前体一般为小于100nt含有茎环结构的小RNA。这些miRNA前体可以单体的形式存在，也可以簇集的形式存在，它们被称为初级miRNA(pri-miRNA)。MiRNA是通过与靶mRNA的3-UTR碱基配对的方式来执行对靶mRNA的转录翻译抑制的功能。在动物中，miRNA靶向mRNA进行不完全配对以进行转录后翻译抑制的作用。　　MicroRNAs与肿瘤的关系也是目前的科学热点。通过对基因组进行大规模的筛查发现:miRNAs表达与多种恶性肿瘤相关，并且这些基因可能起到抑癌基因或癌基因作用。许多研究还表明， miRNAs在HCC中是异常表达的，并且和肿瘤细胞的发生、生长、转移或凋亡有关，这也就提示miR-429可能在肝癌起始过程中起到非常关键的作用。最新的一些研究表明，miR-200家族在许多肿瘤中均存在表达异常的现象，基于以上背景，研究旨在阐明miR-429这一具有预测HCC潜能的miRNA在肝癌起始过程中的作用，进一步明确肝癌发生的分子机制，以期找到HCC早诊断早治疗的新思路和新方法。　　（二）实验方法　　1.利用Taqman探针对循环miR-429进行各组血清大样本以及癌/正常肝组织中miR-429的分别验证。　　2.利用Taqman探针对各种细胞系内，细胞培养上清中的需检测miRNAs进行实时定量PCR，检测目的miRNAs的丰度。　　3.利用LNA-原位杂交技术，检测miR-429在肝癌及癌旁正常组织石蜡样本中的表达丰度。　　4.通过CCK8、PI染凋亡细胞检测、流式细胞术等，研究miR-429与肿瘤生长、抗化疗作用及TICs富集的关系。　　5.通过体外以及体内有限稀释实验，研究miR-429对肿瘤发生过程的影响。　　6.通过磁分选技术富集CD133+及EpCAM+的TICs，通过对其相应基因的表达，干预目的基因后表型的改变，研究miR-429在TICs中的作用。　　7.分离原代人肝癌细胞后，利用磁分选技术富集TICs，检测其中miRNAs以及相关基因的表达，进一步验证miR-429对肝TICs的重要作用。　　8.通过干扰肝癌细胞系中miR-429可能靶基因的siRNA，以及通过干扰后细胞表型的改变验证miR-429的靶基因。　　9.筛选出相应miR-429的靶基因，通过构建该基因的过表达质粒及干扰质粒，进一步构建病毒载体，探讨该基因的生物学功能。　　10.在HCC细胞系HCCLM3/97H中，通过过表达miR-429或者利用Antagomir干扰，从正反两个方面单独验证miR-429对靶基因及细胞表型的调控。　　11.通过免疫共沉淀，染色质免疫共沉淀等方法，研究miR-429靶基因RBBP4与其他分子的相互结合作用。　　12.利用统计学分析，结合临床病理资料，分析miR-429及其靶基因表达、活化水平与肝细胞癌临床病理特征、预后之间的关系。　　（三）结果　　1.miR-429在肝癌组织中表达升高，且组织中表达水平与血清表达水平正相关，提示miR-429表达水平可作为临床预后的预测指标。　　2.利用磁分选肝癌细胞系及原代肝癌细胞，富集EPCAM+及CD133+的肝TICs中，miR-429表达水平升高。　　3.miR-429能够提高肝TICs中EPCAM+细胞的比例，促进细胞的自我更新和化疗抵抗。　　4.miR-429直接靶向抑制抑癌基因RBBP4，调节肝T-ICs的特征，细胞内干扰RBBP4不再增强miR-429的作用，而过表达RBBP4后可部分逆转miR-429的作用。　　5.miR-429可降低细胞中RBBP4的表达，通过RBBP4/E2F1/OCT4信号通路增强E2F1下游转录活性，从而实现促进肝TICs富集的作用。　　6.miR-200b/miR-200a/miR-429上游启动子区CpG岛异常甲基化促进miR-429在肝癌起始细胞中的表达。　　7.分泌型的miR-429被包裹在microparticles中，可作为肝TICs与其他细胞间通信的工具，这提示肿瘤可能具有“传染性”。　　（四）结论　　证明miR-200b/miR-200a/miR-429 miRNA簇上游CpG岛的异常低甲基化修饰促进miR-429在肝癌起始细胞中的表达。肝TICs来源的miR-429能在体外和体内水平通过靶向抑制抑癌基因RBBP4提高肝TICs的自我更新、化疗抵抗和增殖的能力。此外，进一步鉴定了miR-429通过调节RBBP4/E2F1/OCT4信号通路提高了肿瘤中EPCAM+肝TICs的比例，是miR-429实现对肿瘤起始这一过程调节的重要机制。结果提示miR-429是早诊断早治疗HCC的潜在干预靶点。　　二、miR-429通过PTEN/PI3K/AKT信号通路调节肝癌转移侵袭　　（一）研究目的　　原发性肝癌是世界第五大常见恶性肿瘤，超过90％的原发性肝癌是肝细胞性肝癌（HCCs，简称肝癌）。我国是肝癌高发地区，其死亡率在恶性肿瘤中上升至第二位。但是，HCC患者就诊时往往已是晚期，出现包括远处转移或肝内转移等并发症，手术的根治性切除率很低，预后通常很差，而转移复发也一直是影响肝癌治疗效果的重要因素。肝癌的转移是一个涉及许多调控因素的复杂过程。目前已知有肝癌及间质细胞遗传学与表面遗传学的改变引起的基因、细胞表面结构和粘附能力、局部血管生成能力、细胞代谢功能以及癌细胞与宿主、癌细胞与细胞间质之间相互作用等过程的改变参与肝癌的转移。　　肿瘤侵袭和转移过程中癌细胞和癌旁基质之间的相互调节作为一个动态系统已被广泛研究。肝肿瘤微环境一般分为细胞成分和非细胞成分，包括肝实质细胞，肝星状细胞，成纤维细胞，免疫细胞，内皮细胞，间充质干细胞和生长因子，细胞因子，细胞外基质，激素和病毒等。目前研究认为肝脏细胞成分在经历外界不同刺激后，通过促进细胞坏死、凋亡以及分泌多种蛋白形成炎症微环境，从而参与肝肿瘤的发生和发展。由于肝细胞癌引起死亡的主要原因是肿瘤的进展和转移，因此深入研究肿瘤转移过程中重要的节点分子将有助于系统性阐述肝癌转移的分子机理。miRNA的发现描述了一种全新的基因活动形式，即转录后翻译水平的修饰。大量互相影响并且在幕后控制分子的miRNA分子参与了这种活动。研究者利用各不相同的方法，从而增加了miRNA网络的基础性发现的科学性。近年来，有大量关于促转移和抑制转移基因、miRNA和细胞代谢在肝癌转移中作用机制的研究，在一定程度上揭示了肝癌的转移复发的调控机制，但是，对于肝细胞癌的基础研究和临床治疗而言，一个必须重视的命题是对肝细胞癌的预后影响因素进行深入研究。　　课题组发现循环miR-429具有早期预警及诊断肝细胞性肝癌的潜能;miR-429可以调节肝癌细胞的生长，化疗抵抗及自我更新，此外，运用生物信息学技术分析，发现miR-429可直接靶向抑制人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)。PTEN位于人10号染色体长臂23.3区，它属于蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP，protein tyrosine phosphatases)基因家族成员。作为一个著名的抑癌基因，目前已发现大部分实体肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌及恶性黑色素瘤等均存在PTEN基因的突变和失活。PTEN主要能在体内及体外使磷脂酰肌醇(3，4，5)-三磷酸(PIP3)脱磷酸，而PIP3可上调AKT活性。PTEN正是通过其磷酸酶的作用维持PIP3的低水平，从而抑制PI3K/AKT信号通路的活性， PTEN/PI3K/AKT通路的失调与肿瘤发生发展也关系十分密切。PTEN/PI3K/AKT可通过多种途径调节下游的分子Racl，Rho等，促进细胞骨架重构;也可以调节金属基质蛋白酶(MMPs)等促进细胞的侵袭。研究表明，PTEN的下调或缺失导致PI3K/AKT通路活化可使肿瘤的转移和侵袭能力增强，而PTEN的过表达则可抑制细胞的转移。　　综上所述，猜想miR-429在肝癌中的高表达，除了可影响肝TICs细胞的生长，化疗抵抗及自我更新能力之外，可能还可以通过靶向抑制其他分子调节肝癌细胞的转移侵袭能力。而miR-429可能靶向抑制PTEN这一发现提示我们miR-429可能在肝癌起始过程中起到非常关键的作用。最新的一些研究表明，miR-200家族在许多肿瘤中均存在表达异常的现象，基于以上背景，研究旨在阐明miR-429这一具有预测HCC潜能的miRNA在肝癌起始过程中的作用，进一步明确肝癌发生的分子机制，以期找到HCC早诊断早治疗的新思路和新方法。　　（二）实验方法　　1.收集临床肝癌病人门静脉癌栓/肝癌原发灶/癌旁正常肝组织新鲜冰冻配对样本。　　2.利用实时定量PCR对门静脉癌栓/肝癌原发灶/癌旁正常肝组织样本中miR-429的表达水平进行验证。　　3.利用LNA-原位杂交技术，检测miR-429在门静脉癌栓/肝癌原发灶/癌旁正常肝组织样本的表达丰度。　　4.通过甲基化质谱技术(MassARRAY EpiTYPER)检测门静脉癌栓/肝癌原发灶/癌旁正常肝组织样本中miR-200b/miR-200a/miR-429上游CpG岛甲基化水平，并验证其是否与miR-429表达水平负相关。　　5.通过transwell， matrigel transwell等实验研究miR-429与肿瘤转移，侵袭等表型的关系。　　6.通过构建miR-429靶基因3UTR和其突变体的质粒(PTEN)，以及通过干扰、过表达实验，验证PTEN确实是miR-429的靶基因，并探讨其下游信号转导通路。　　7.在HCC细胞系HCCLM3/MHCC97H中，通过过表达miR-429或者利用miR-429 inhibitor干扰，从正反两个方面单独验证miR-429对PTEN及细胞转移表型的调控。　　8.通过构建PTEN的过表达质粒及干扰siRNA，以及使用PI3K/AKT通路抑制剂，进一步探索miR-429调节肝癌转移侵袭的作用机制。　　9.通过裸鼠尾静脉注射肝癌细胞肺转移实验，体内水平验证相应miR-429及其靶基因在肝癌转移侵袭中的作用。　　10.利用统计学分析，结合临床病理资料，分析miR-429及其靶基因表达、活化水平与肝细胞癌临床病理特征、预后之间的关系。　　（三）结果　　1.miR-429在门静脉癌栓、肝癌原发灶及癌旁正常组织中的表达逐渐降低，提示miR-429表达水平可作为肝癌转移复发的潜在预测指标。　　2.与其表达水平相符的是，miR-200b/miR-200a/miR-429上游CpG岛的甲基化水平在门静脉癌栓、肝癌原发灶及癌旁正常组织中的表达逐渐升高，提示DNA甲基化修饰在miR-429的高表达中起重要调控作用。　　3.miR-429在体内及体外均能够促进肝癌细胞转移，侵袭。　　4.miR-429直接靶向抑制抑癌基因PTEN，调节肝癌侵袭迁移的表型，细胞内干扰PTEN不再增强miR-429的促转移作用，而过表达PTEN后能够逆转miR-429的作用。　　5.miR-429可降低细胞中PTEN的表达，激活PI3K/AKT信号通路，最终引起β-Cantenin的核转位，从而实现促进肝癌转移侵袭的作用。　　6.miR-429与肝癌患者的肿瘤体积、微血管侵润有关系，提示其对于肿瘤转移侵润的作用。　　（四）结论　　证明miR-200b/miR-200a/miR-429 miRNA簇上游CpG岛的异常低甲基化修饰促进miR-429在肝癌起始细胞中的表达。miR-429能在体外和体内水平通过靶向抑制抑癌基因PTEN提高肝癌转移侵袭能力。此外，进一步鉴定了miR-429通过调节PTEN，激活PI3K/AKT信号通路，最终引起β-Cantenin的核转位，实现其促进肝癌转移侵袭的作用，这是miR-429实现对肝癌进展的重要调节机制。结果提示miR-429是干预治疗HCC进展的潜在干预靶点。