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内切葡聚糖酶（endo-1,4-β-D glucanase,EC3.2.1.4）是纤维素水解酶系的重要组分,可随机作用于纤维素长链内部,即在β-1,4-糖苷键将其切断,降解为小分子多糖。内切木聚糖酶（endo-1,4-β-D-xylanohydrolase,EC3.2.1.8）是木聚糖降解酶系中最主要的成分,它可特异性的作用于木聚糖长链上的β-1,4糖苷键,将木聚糖水解为低聚木糖及少量的木二糖及木糖。本论文从内蒙古、深圳红树林等多地的碱湖、淤泥中分离得一批产纤维素酶、半纤维素酶的菌株。其中,嗜碱链霉菌Streptomyces sp.H31可同时产生宽pH适应性的中性内切葡聚糖酶及耐碱性内切木聚糖酶。本文克隆了该菌株的内切葡聚糖酶新基因egh31及内切木聚糖酶新基因xynh31,进而在大肠杆菌和里氏木霉中进行了高效表达,并对其酶分子进行了改造。主要内容如下:（一）链霉菌Streptomyces sp.H31的筛选本课题从天然碱性环境中筛选到一批可分泌纤维素酶及半纤维素酶的菌株。其中菌株H31表现出较高的产酶能力,其发酵液中内切葡聚糖酶酶活为4.12 U/mL,内切木聚糖酶酶活达51.4 U/mL。通过16S rDNA序列分析结合外观形态综合判断其分类为链霉菌属（Streptomyces）。Streptomyces sp.H31属于嗜碱菌,具有可在高碱性条件（pH 9.0）下培养的优点,在大规模发酵生产时可减少杂菌污染。（二）内切葡聚糖酶基因egh31的克隆、原核及真核表达以链霉菌Streptomyces sp.H31的基因组DNA为模板成功克隆到内切葡聚糖酶基因egh31,该基因包含762 bp的完整开放阅读框（ORF）,共编码253个氨基酸,理论等电点（pI）为5.03,分子量为26.58 kDa。经BLAST分析,发现其编码的氨基酸序列属于糖苷水解酶第12家族,与来源于Streptomyces sp.CC77的第5家族（glycosyl hydrolase family 5）β-1,4-内切葡聚糖酶的相似度最高,一致性为83%。该基因在大肠杆菌E.coli BL21和真菌里氏木霉T.reesei QM9414中得到了高效表达,其酶活性分别达到13.6 U/mL和31.46 U/mL,其比活分别为153.7 U/mg和161.2U/mg。酶学性质实验结果显示:该酶最适温度为60℃,最适反应pH值为7左右,在pH 3-11之间稳定性较高;金属离子Ca2+、Zn2+及Ni2+对其酶活力有较高的促进作用,而Mg2+、Fe3+及Al3+则对其酶活力有一定的抑制作用;该酶在SDS及市售洗涤剂中具有较好的耐受性;EDTA对该酶的酶活性影响甚微。实验证明内切葡聚糖酶Egh31同时具有中性、碱性内切葡聚糖酶的优点,是具有宽pH适应范围的优良工业用酶。综合酶学性质及基因同源性分析,初步推断egh31基因为新的β-1,4-内切葡聚糖酶基因。（三）内切木聚糖酶基因xynh31的克隆及原核表达本文通过阳离子交换层析从Streptomyces sp.H31菌株发酵液中分离纯化得到内切木聚糖酶Xynh31,其分子量约为42 kDa,理论等电点（pI）8.18,比活为671.63U/mg。酶学特性研究结果表明,该木聚糖酶的最适反应pH值为7-9,最适反应温度为50℃左右,在中、碱性条件下具有较高酶活,热稳定性较高。对金属离子及去污剂等耐受性较好。该酶符合造纸工业用酶的基本要求,具有良好的应用前景。利用糖苷水解酶第10家族保守区域设计简并引物,成功克隆到内切木聚糖酶基因xynh31的完整开放阅读框（ORF）。该ORF长1380 bp,编码459个氨基酸。BLAST分析结果表明,其氨基酸序列与来源于Streptomyces Halstedii Jm8的第10家族的木聚糖酶Xylanase A相似性最高,但一致性最高仅为82%。根据序列分析结果,结合酶蛋白分子量、理论等电点及酶学特性等方面的差异,推断该基因为一新发现的β-1,4-内切木聚糖酶基因。利用大肠杆菌对该基因进行表达,其最高酶活可达186.3 U/mL,重组内切木聚糖酶的比活为628.4 U/mg,重组酶与野生酶酶学性质基本一致。（四）内切葡聚糖酶Egh31及木聚糖酶Xynh31的酶分子改造通过序列比对及蛋白结构同源建模分析可知,内切葡聚糖酶Egh31缺少结合结构域,因此在其基因的C末端添加了来源于嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.Ⅲ-3的内切葡聚糖酶的结合结构域（CBD）。实验结果表明添加了CBD的重组内切葡聚糖酶的温度稳定性在55℃条件下提高约30%;并且在1%SDS条件下,酶活性比原Egh31提高约40%。实验结果表明:添加结合结构域的内切葡聚糖酶Egh31在纺织业的酶洗整理和洗涤剂工业具有较好的工业应用前景。本文利用生物信息学方法同源模拟了木聚糖酶Xynh31的蛋白3D结构,并预测其可能的催化位点。利用定点突变技术构建了E171D/E279D突变体,证明了所预测的171,279位谷氨酸（Glu）是活性催化位点。通过定点突变,选取Xynh31蛋白第210位氨基酸赖氨酸,将其突变为精氨酸,结果发现突变体Xynh31-K210R最适反应温度比重组酶Xynh31提高了5℃,且在60℃下保存60 min,其残余酶活力仍高达60%以上,表明本文通过定点突变引入精氨酸,成功提高了内切木聚糖酶Xynh31的热稳定性。通过本论文研究,得到了酶学性质优良的新型中性内切葡聚糖酶及耐碱性内切木聚糖酶,并对它们进行了酶分子改造,初步探讨了内切葡聚糖酶及内切木聚糖酶结构与功能之间的关系。本研究丰富了内切葡聚糖酶及内切木聚糖酶的工业应用选择,也为工业用酶的酶分子改造提供了依据。