【摘 要】
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葡萄霜霉病是中国葡萄生产上的第一大病害,每年造成的产量损失极大。化学防治是目前防治该病的常用措施,长期大量使用化学农药易导致抗药性产生,易导致产品和环境污染。挖掘抗病基因,选育抗病优质葡萄品种已成为研究热点。葡萄霜霉病抗病机理已有一定报道,但利用抗感鲜食葡萄转录组测序挖掘抗病基因,并对抗病候选基因脱落酸受体VvPYL4开展相关功能分析尚未见报道。本文以葡萄霜霉病菌为靶标,开展了葡萄品种对霜霉病抗病
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葡萄霜霉病是中国葡萄生产上的第一大病害,每年造成的产量损失极大。化学防治是目前防治该病的常用措施,长期大量使用化学农药易导致抗药性产生,易导致产品和环境污染。挖掘抗病基因,选育抗病优质葡萄品种已成为研究热点。葡萄霜霉病抗病机理已有一定报道,但利用抗感鲜食葡萄转录组测序挖掘抗病基因,并对抗病候选基因脱落酸受体VvPYL4开展相关功能分析尚未见报道。本文以葡萄霜霉病菌为靶标,开展了葡萄品种对霜霉病抗病性鉴定、霜霉病菌侵染葡萄叶片转录组分析、抗病相关差异表达基因挖掘及功能研究,主要研究结果如下:1.不同葡萄品种对霜霉病抗病性鉴定结果表明,室内离体叶片接种鉴定出高抗品种4个,抗病品种31个,感病品种32个,高感品种18个;田间自然发病调查结果显示高抗品种1个,抗病品种25个,感病品种45个,高感品种14个;在供试品种中,未见对霜霉病完免疫的品种。不同品种抗病性总体趋势由强到弱依次为美洲种、欧美杂交品种（系）和欧亚杂交品种（系）。2.利用Illumina HiSeqTM2000对高感霜霉病品种无核白鸡心和高抗霜霉病品种贝达应答霜霉病菌侵染的转录组测序分析表明,抗病品种中发现差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）有1091个,感病品种中差异表达基因有849个,差异表达基因中以下调差异基因数量占多数,高抗品种贝达差异表达基因明显多于高感品种无核白鸡心;egg NOG直系同源分类表明,差异表达基因可注释为一般功能预测、转录后修饰、蛋白转化、分子伴侣和信号转导机制功能;Gene ontology功能分析显示差异表达基因注释到代谢过程数量最多并显著富集;KEGG代谢通路注释发现差异表达基因在植物与病原菌互作、植物激素信号转导、类黄酮合成及苯丙烷类合成等代谢通路显著富集。采用q RT-PCR技术检测了18个差异基因在霜霉病菌诱导后的表达情况,其差异表达趋势与转录组测序结果基本相同。3.葡萄应答霜霉病菌侵染的抗病相关差异表达基因分析表明,葡萄叶片通过植物与病原菌互作途径中基因的诱导表达产生防卫反应,并通过脱落酸（Abscisic acid,ABA）、茉莉酸（Jasmonic acid,JA）、水杨酸（Salicylic acid,SA）、油菜素甾醇（Brassinosteroids,BRs）、生长素和细胞分裂素信号转导通路和苯丙烷生物合成、苯丙氨酸代谢、类黄酮生物合成等代谢通路中关键基因的表达调控响应霜霉病菌侵染。高抗品种贝达转录因子差异表达基因数量多于高感品种无核白鸡心,抗感品种差异表达的转录因子既表现特异性,也存在部分重叠。利用HMMER 3.0 program和The Plant Resistance Gene Database对抗感葡萄品种中差异表达基因进行抗病相关基因筛选,获得抗病候选基因为196个。4.从葡萄中克隆了脱落酸受体基因VvPYL4（Vitis vinifera,Pyrabactin resistance 1-like4）全长,亚细胞定位显示VvPYL4定位于细胞核和细胞质。外源ABA和Me JA可提高葡萄叶片对霜霉病菌的抗性;q RT-PCR分析表明,在葡萄霜霉病菌胁迫和激素ABA和Me JA处理下,可显著诱导VvPYL4的表达。利用病毒诱导基因沉默（Virus-induced gene silencing,VIGS）技术瞬时转化‘贝达’葡萄叶片获得VvPYL4沉默植株,发现VvPYL4基因沉默可降低葡萄对霜霉病菌的抗性,VvPYL4基因在葡萄响应霜霉病菌胁迫中扮演着正调控因子角色。此外,VvPYL4基因沉默后抑制了ABA信号通路中Sn RK2.2和ABF1基因以及JA信号通路中JAR1和MYC2基因的表达。VvPYL4通过调控ABA和JA信号通路相关基因表达参与葡萄对霜霉病菌侵染的应答。
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