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组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶(Histone lysine specific demethylase 1,LSD1)是在2004年发现的第一种组蛋白去甲基化酶。LSD1能够以黄素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinucleotide,FAD)依赖性酶催化氧化的方式去除组蛋白H3K4和H3K9的单双甲基。蛋白neddylation修饰作为一种类泛素化修饰,是机体发挥正常功能的调节方式,然而在肿瘤及神经退行性等疾病中却发生异常活化,neddylation通路E1激活酶NAE的抑制剂MLN4924已经进入临床前研究,发现其对多种肿瘤都有很好的抑制活性。然而最近研究发现MLN4924在肿瘤治疗过程中出现抗性,以及neddylation通路的E2结合酶UBE2M被证实在肺癌中是一种很好的治疗靶点。课题组前期发现LSD 1可以增强胃癌细胞MGC-803的迁移和侵袭。本文意在研究(1)LSD1是否存在neddylation修饰以及UBE2M是否会对其产生影响;(2)UBE2M是否对胃癌细胞的增殖与迁移产生影响以及LSD1在其中是否发挥作用。(1)LSD1与UBE2M/UBE2F在胃癌组织中表达量的呈现正相关本课题组对收集得到的胃癌组织进行免疫组化实验,检测LSD1以及两种neddylation E2结合酶UBE2M和UBE2F分别在细胞质与细胞核中的表达情况。分析结果发现,LSD1与UBE2M以及LSD1与UBE2F的蛋白表达都存在着正相关,但是LSD1与UBE2M的蛋白表达相关性(r=0.2843,p<0.0001)明显高于LSD1与UBE2F之间的相关性(r=0.1593,p=0.0002)。同时,LSD1与细胞核中UBE2M的蛋白表达量相关性(r=0.3254,p<0.0001)显著高于LSD1与细胞质中UBE2M的相关性(r=0.1323,p=0.0130)。并且,性别、淋巴结转移以及分化程度这些病理特征对于LSD1与UBE2M的相关性都具有一定程度的影响。通过以上结果可以得知,在胃癌组织中,LSD1与neddylation通路中的两种E2结合酶UBE2M和UBE2F的蛋白表达都存在正相关,但是LSD1与UBE2M之间的蛋白表达相关性明显更高一些,说明LSD1与UBE2M之间更有可能存在着相互作用,而LSD1与细胞核中UBE2M的蛋白表达相关性明显高于LSD1与细胞质中UBE2M之间的相关性,则说明二者相互作用的部位可能位于细胞核。(2)胃癌细胞中LSD1与UBE2M蛋白相互作用及LSD1 neddylation修饰的确定通过对胃癌细胞MGC-803中UBE2M蛋白结合物进行质谱鉴定,发现其中存在多聚泛素链,并且其中LSD1的泛素化修饰位点为K280(由于目前技术的局限性,还不能将泛素与类泛素分子区别开)。通过免疫共沉淀实验,细胞免疫荧光实验和Western-blot实验结果表明,LSD1和UBE2M共定位于细胞核,并且二者存在蛋白间相互结合,以及LSD1存在着neddylation修饰。(3)胃癌细胞中UBE2M相互作用蛋白可促进LSD1 neddylation修饰及UBE2M对LSD1蛋白表达存在负向调节通过将胃癌细胞MGC-803中UBE2M的蛋白复合物与本课题组重组的LSD 1进行体外neddylation反应后,可以发现LSD 1的neddylation修饰明显增强。这些结果说明,UBE2M与其相互作用的蛋白作为neddylation通路的相关酶完成了 LSD 1 的 neddylation 修饰。在胃癌细胞系 AGS、BGC-823、HGC-27、MGC-803、MKN45、NCI-N87中研究发现,敲低UBE2M之后,LSD1表达量普遍具有升高的趋势,而过表达UBE2M后,LSD1的表达量具有下降的趋势。以上结果表明,在胃癌细胞中UBE2M对于LSD1的表达量总体上是具有下调功能的。(4)在一定程度上UBE2M依赖于LSD1促进胃癌细胞MGC-803的迁移经MTT实验检测发现,UBE2M对于胃癌细胞的增殖因细胞系的不同呈现出不同的结果。降低UBE2M的表达量可以普遍抑制胃癌细胞的增殖能力;过表达UBE2M可以抑制BGC-823细胞的增殖,促进AGS和HGC-27细胞的增殖,但对其它胃癌细胞的增殖没有明显的影响。由划痕结果表明,在一定程度上UBE2M依赖于LSD 1促进胃癌细胞MGC-803的迁移。综上所述,neddylation E2结合酶UBE2M在细胞核中与LSD 1相互作用,促进LSD1的neddylation修饰。UBE2M对于胃癌细胞的增殖存在一定的影响,但没有呈现出明显的规律性。UBE2M可以下调胃癌细胞中LSD1的表达量,而在一定程度上UBE2M依赖于LSD1促进胃癌细胞MGC-803的迁移。本课题探索了 UBE2M对于胃癌细胞中LSD1 neddylation修饰,LSD1表达量以及胃癌细胞增殖与迁移的影响,为针对胃癌LSD1抑制剂的研究开拓了思路。