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在我国,白粉病是小麦和大麦等禾谷类作物上的重要病害。引起小麦白粉病的病原菌是禾布氏白粉菌小麦专化型（Blumeriagraminis f.sp.tritici,Bgt）。它是一种专性寄生真菌,在我国麦区分布广泛,可远距离传播,对不同的小麦品种具有明显的小种分化,且毒性变异快。培育和种植抗病品种是防治白粉病最经济、有效和环保的措施之一。由主效抗病基因介导的小种专化抗病性在白粉病抗病育种中得到了广泛的应用。然而,寄主垂直抗性给病原菌施加了选择压力,使得病原菌群体中毒性小种出现和不断积累,最终导致品种抗性被克服。针对上述问题,一方面需要对病原菌群体致病型进行监测,进一步克隆无毒基因,了解毒性变异的分子机制,以便更加有效地利用抗病基因。另一方面需要对品种抗性进行改良,加快持久抗病品种的培育进程。本研究拟开展如下两方面的工作。1)对我国白粉菌群体致病型进行多样性分析,筛选出具有不同致病谱的菌株,采用比较基因组学研究方法鉴定无毒基因,并揭示其变异规律。2)采用转录组学分析方法对白粉菌无性产孢相关基因进行研究,筛选出控制产孢的关键基因,并利用基因沉默技术明确其功能,为RNAi介导的持久抗病品种的培育提供候选靶标基因。为了从全国范围内了解小麦白粉病菌致病型的多样性,2011年,从我国8个小麦主产区采集分离了 1,082个单孢子堆菌株。采用离体叶段接种法在22个持有单个Pm基因的鉴别寄主上进行了致病性测定。结果表明,共检测到1,028种致病型,其中984种致病型只包含1个菌株。所有菌株对22个鉴别寄主的毒性频率分布在0%-97.4%之间。没有发现对Pm21表现毒性的菌株。8个菌群对Pm13的毒性频率均小于17.0%。相反,至少有56.0%的菌株对Pm1a、Pm3b、Pm3c、Pm3f\Pm5a、Pm6和Pm8表现亲和。表型多样性分析发现各群体内存在丰富的致病型多样性。卡方检验结果表明,8个菌群对单个Pm基因的毒性频率存在显著差异（p<0.01）。这些Pm基因包括Pm1a,Pm2,Pm3a,Pm3b,Pm3c,Pm3d,Pm3e,Pm3f,Pm4a,Pm4b,Pm5b,Pm7,Pm8,Pm17 和 Pm19。这反映出群体间毒性结构的差异。而且,基于无毒位点的群体间遗传多样性与菌群间地理距离之间存在显著的正相关（R2=0.494,p<0.001）。由于与其他菌群地理距离较远,新疆的菌群可能是一个隔离的群体。成对无毒位点之间的正/负关联分析表明,26对与31对位点在所有菌株中分别具有显著的正关联与负关联（p<0.05）。这些结果不仅为抗病基因的布局提供了依据,而且为无毒基因的克隆提供了材料。为了克隆无毒基因,采用二代Illumina与三代PacBio测序平台对菌株21-2基因组进行了测序和从头组装,并进行了重复序列去除,基因预测和功能注释。对99个致病型差异明显的菌株基因组进行了重测序,并通过与参考基因组比对获得了 SNP（Single nucleotide polymophism）,InDel（Insertion/Deletion）和片段有无变异（Presence/Absence variation,PAV）数据。为了克隆AvrPm2,对effector基因型与AvrPm2表型进行了关联分析和候选基因的PCR验证,并对候选基因进行了序列分析和表达谱分析。结果表明,实际组装的参考基因组大小为132.4Mb,Scaffold数为2,654,N50长度为80.9kb。与菌株96224基因组相比,组装质量有了显著提高。将重复序列（74.7%）和非编码RNA（0.06%）屏蔽后,从剩下的序列中获得了 6,770个基因,并为其中6,743个基因分配了功能注释。Effector基因预测结果表明,菌株21-2含有644个effector,包括544 CSEP（candidate secreted effector protein）和 192 个 CEP（candidate effector protein）。重测序数据分析从99个菌株鉴定出大量的SNP,InDel和PAV变异。在effector基因中,分别有58个和30个基因存在>100bp和>500bp的PAV变异。将这两种PAV变异分别与100个菌株对Pm2的表型进行Fisher’s精确检验,结果发现4个基因的PAV变异与AvrPm2表型极显著关联（p<0.01）,其中Bgt21-2005279的p值最小（p<0.001）。手工检查发现,97个菌株中Bgt21-2005279的PAV变异与AvrPm2表型变异相一致。说明该基因为AvrPm2的候选基因。该基因所在区域12Kb的缺失可使无毒菌株获得对Pm2的毒性,且缺失区域含有LTR（long terminal repeat）类转座子。2个菌株不含该基因但表现无毒,而1个菌株含有该基因但表现毒性,提示AvrPm2表型可能还与其他基因变异有关。基因序列分析表明,该基因编码一个119个氨基酸的蛋白,N端信号肽下游具有保守的Y（x）xC和RxFC基序,是一个核糖核酸酶类effector蛋白。转录组数据分析表明,该基因在2dpi（days post inoculation）吸器中高表达。这些结果说明RNase-like effector在禾谷类白粉菌毒性变异中起重要作用。为了揭示禾谷类白粉菌产孢分子机制,对菌株21-2营养菌丝发育时期（3dpi）,足细胞形成期（4dpi）和分生孢子梗形成期（5dpi）的叶表面菌体转录组进行了测序。差异表达分析结果表明,相对于3dpi时的表达量,685个基因在产孢阶段（4dpi和5dpi）差异表达。其中分别有556和404个基因在4dpi和5dpi差异表达。在与初生代谢相关的基因中,参与多种糖转化生成葡萄糖,糖酵解,三羧酸循环,电子传递链和不饱和脂肪酸氧化的基因被激活。说明白粉菌产孢阶段需要更多能量。而且,葡萄糖同时被转化为糖原,在分生孢子梗中积累,作为主要的能量储备用于下次侵染。对91个编码调控因子的基因表达谱进行了聚类分析,发现钙离子,H202,磷脂酰肌醇介导的信号通路与产孢密切相关。DAB染色结果发现在分生孢子梗中有大量的H202积累。钙离子螯合剂EGTA和钙调蛋白（Calmodulin,CaM）抑制剂TFP处理后,白粉菌H202水平显著下降,且足细胞和分生孢子梗数目显著减少,导致产孢量显著降低。这些结果说明,钙离子和H202介导的信号通路在产孢中起重要作用,且二者存在交联。另外,除了发现其他真菌中已知的产孢相关同源基因之外,还发现了一些禾谷类白粉菌特有的基因,这提示禾谷类白粉菌无性产孢可能还存在与其他真菌不同的分子机制。。产孢阶段差异表达分析发现1个蛋白激酶基因可能在产孢阶段钙离子或H202介导的信号通路中扮演重要角色。序列分析表明,该基因编码一个具有核定位信号的KSP1类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因（STPK2）。为进一步明确它在产孢过程中的作用,采用病毒介导的基因沉默（VIGS）技术对白粉菌内源的STPK2基因进行了沉默。定量PCR结果证明STPK2在5dpi时显著下降（p<0.01）。组织学观察结果表明,该基因的沉默导致白粉菌足细胞形成率,分生孢子梗形成率以及产孢量均显著下降（p<0.01）,病害症状明显减轻。这些结果说明,STPK2在禾谷类白粉菌产孢过程中是必须的,可以作为用于持久抗病育种的候选靶标基因。