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目的:从孤雌胚胎产生的胚胎干(ES)细胞可选择作为一种组织相容性的细胞和组织的来源用于替代治疗。本实验主要是尝试从小鼠的孤雌囊胚建立胚胎干细胞系并对其进行鉴定,在此基础上探究其印记基因的表达和运动神经元分化的情况。
方法:我们通过聚合两个8-细胞期的孤雌胚胎来增加内细胞团的细胞数量,分别从普通孤雌囊胚及聚合-孤雌囊胚的内细胞团(inner cell mass,ICM)分离培养、建立孤雌胚胎干细胞(pathenogenetic embryonic stem cells,PgES cells)系和聚合-孤雌胚胎干细胞(aggregated-pathenogenetic ES cells,a-PgES cells)系;对建立的细胞系进行相关的多潜能鉴定;并用RT-PCR和Real-time PCR检测了印记基因的表达;此外我们通过转录因子和细胞外基质的联合应用直接从PgES胞诱导产生了运动神经元。
结果:B6D2F1小鼠的卵母细胞孤雌激活率为93.2%:建立了4株孤雌胚胎干细胞系和l株聚合-孤雌胚胎干细胞系,建系成功率分别为7.8%和11.1%,然而这两种细胞类型之间在建立率上没有显著差异。经鉴定其细胞克隆与小鼠ES细胞的克隆形态学上没有差别,表达多潜能标记Oct4及细胞表面标记SSEA-1,有高水平的碱性磷酸酶活性,在细胞第10代和第30代时核型分析检测显示为正常的40XX染色体,与卵母细胞起源一致。体外拟胚体(EB)中诱导的细胞结构中表达三个胚层标记。将PgES和a-PgES细胞注射到免疫缺陷裸鼠的皮下获得了包含三胚层结构的畸胎瘤。PgES细胞注射到ICR小鼠的囊胚腔中,移植获得了嵌合鼠。RT-PCR和Real-time PCR检测到在PgES和a-PgES细胞中一些父源表达的印记基因的激活。与PgES细胞相比,在a-PgES细胞中母源和父源的印记基因的表达都是下降的。全反式维甲酸(RA)、SHH及细胞外基质的联合应用直接从PgES细胞诱导产生了表达HB9标记的运动神经元。
结论:孤雌胚胎干细胞可以由两种不同的方法获得且显示出不同的印记基因的表达;这些细胞有向运动神经谱系分化的能力,可用于研究基因组印记和神经分化的相关性。