卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤,发病率在女性常见恶性肿瘤中排名第六位,致死率在女性恶性肿瘤中排名第五位。卵巢癌作为一种高侵袭性的妇科肿瘤,由于出现症状时大多为晚期,盆腹腔广泛转移病灶,实施理想的减瘤术有一定的困难,其五年生存率仅在25-30%。所以研究卵巢癌侵袭转移机制的意义重大。肾上腺髓质素(Adrenomedullin AM)是由日本学者Kitattra等于1993年自人肾上腺髓质嗜铬细胞瘤中发现的多肽类,因其在肾上腺髓质中的含量高,故被称为肾上腺髓质素。AM在体内分布广泛,有多种生物学效应,可作为循环激素、旁分泌激素及自分泌激素参与体内多种生理、病理过程,在肿瘤发生发展中起到重要的作用。　　 有研究表明,在卵巢癌组织及细胞系中有AM的受体——降钙素受体样受体(CRLR)及受体活性修饰蛋白(RAMPs)的表达。卵巢癌细胞系CAOV3可以在bFGF的刺激下自分泌AM,促进肿瘤细胞增殖。这些均证明了AM可能在卵巢癌的发展中起到重要的作用。　　 在本实验中,我们用免疫组化法检测并分析了96例中国患者卵巢癌组织中AM表达以及临床预后意义,并且通过迁移实验、蛋白印迹等实验研究AM在卵巢癌细胞中的作用及机制。　　 实验方法：　　 1、通过免疫组化染色SP法,检测96例卵巢上皮性癌中AM的表达,本实验石蜡标本取自2004年01月至2008年12月在中国医科大学附属第一医院住院行手术治疗,术前未行化疗和放疗,术后均经病理检查确诊的卵巢癌病例。由两名病理诊断医师确定肿瘤的病理学分型以及组织学分级。　　 2、应用不同时间、不同浓度的AM作用于卵巢癌细胞HO8910上,划痕实验检测细胞迁移功能。　　 3、利1用siRNA内源性干扰AM受体CRLR,应用AM22-52外源性阻断AM的受体CRLR,观察AM对不同细胞迁移功能的影响。　　 4、应用AM后利用流式细胞术检测细胞表面整合素α5的表达。　　 5、利用蛋白印迹法检测应用AM后细胞的FAK、paxillin及相关磷酸化蛋白量的变化。　　 6、利1用蛋白印迹法检测应用AM后细胞的ERK1/2、AKT及磷酸化蛋白量的变化。　　 7、利用划痕实验检测整合素α5β1抑制性抗体对细胞的迁移能力影响,及对AM促细胞迁移作用的影响。　　 8、利用划痕实验检测PD98059对细胞的迁移能力影响,及对AM促细胞迁移作用的影响。　　 9、利用划痕实验检测Wortmannin对细胞的迁移能力影响,及对AM促细胞迁移作用的影响。　　 10、利用蛋白印迹法检测整合素α5β1抑制性抗体对细胞FAK、paxillin蛋白磷酸化的影响,及对AM促FAK、paxillin磷酸化作用的影响。　　 11、利用蛋白印迹法检测整合素α5β1抑制性抗体对细胞ERK1/2、AKT蛋白磷酸化的影响,及对AM促ERK1/2、AKT磷酸化作用的影响。　　 实验结果：　　 一、AM的表达与EOC的临床病理学参数相关性研究:　　 AM在EOC细胞的胞膜以及胞浆中表达,部分癌旁间质以及血管内皮细胞中也可以见到AM蛋白表达。AM的表达与FIGO分期呈正相关,AM高表达提示不理想的首次减瘤术。根据Kaplan-Meier法分析发现AM高表达组的无瘤生存时间明显少于低表达组。并且高表达组的总生存时问也少于低表达组。根据COX单因素风险分析得出AM高表达是卵巢癌无瘤生存时间和总生存时间的风险因素。　　 二、AM促进卯巢癌细胞H08910的迁移:　　 AM促卵巢癌细胞HO8910的迁移作用为时问依赖性和剂量依赖性。应用AM22-52(AM受体抑制剂)外源性干扰细胞,放入AM22-52的细胞在划痕实验中的愈合率较对照正常细胞的愈合率稍降低,并且提前1小时加入AM22-52可以拮抗AM的促迁移作用。应用siRNA干扰CRLR后的细胞迁移率低于阴性对照siRNA转染后的细胞,并且在AM100nM作用后CRLRsiRNA干扰组的细胞迁移率明显低于对照组。　　 三、外源性AM可以提高H08910细胞整合素α5β1的表达,并且促进下游蛋白FAK,paxillin的磷酸化:　　 AM提高整合素α5β1活性的表达。应用流式细胞仪检测阴性对照细胞以及AM(100nM)处理后细胞的整合素α5表达,发现AM处理后的细胞表面整合素α5表达增加。并且AM可以提高FAK、paxillin蛋白磷酸化,但不影响非磷酸化蛋白总量。预先应用整合素α5β1抑制性抗体(5μg/ml),可以抑制AM对卵巢癌细胞HO8910的促迁移作用(P=0.000),并可以拮抗AM的促FAK、paxillin磷酸化。　　 四、AM促进细胞AKT的磷酸化,AKT抑制剂Wortmannin干扰AM的促迁移作用:　　 外源性增加AM(100nM)15分钟就可以促进AKT磷酸化增加,并且随作用时间延长,磷酸化AKT水平增加,60分钟达最高,而并不影响非磷酸化的蛋白总量。应用PI3K抑制剂Wortmannin(1μM)可以有效抑制AM的促迁移作用,单纯应用Wortmannin(1μM)不能抑制正常HO8910细胞迁移。　　 五、AM可以促进ERK1/2的磷酸化,PD98059抑制AM的促细胞迁移作用:　　 外源性增加AM(100nM)15分钟就可以使ERK1/2磷酸化明显增加,并不影响非磷酸化AKT蛋白总量。应用ERK磷酸化抑制剂PD98059(50μM)可以有效抑制AM的促卵巢癌迁移作用,单纯应用PD98059不抑制正常HO8910细胞迁移。　　 六、整合素α5β1参与AM促AKT、ERK1/2磷酸化作用　　 预先应用整合素α5β1中和性抗体可以部分抑制AM促AKT、ERK1/2磷酸化作用。　　 结论：　　 1、AM的表达与卵巢癌的临床FIGO分期呈正相关。　　 2、AM与卵巢癌患者的预后相关。1　　 3、AM可以通过激活CRLR受体促进卵巢癌细胞迁移。　　 4、AM促细胞表面的整合素α5β1表达,其下游的FAK、paxillin同时被AM激活,促进卵巢癌细胞迁移。　　 5、AM可以活化卵巢癌细胞内PI3K/AKT、MEK/ERK信号通路,从而促进细胞迁移。　　 6、整合素α5β1是AM促细胞迁移的感受器,部分参与到AM对卵巢癌细胞PI3K/AKT、MEK/ERK信号通路活化作用。