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目的：
结肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，其发病率高、死亡率高、预后差。结肠癌在临床上主要采用以5-氟尿嘧啶为核心的化疗方案，但不少病人在治疗的初期或治疗一段时间后出现药物耐受，这严重限制了化疗药的应用。促凋亡信号通路的缺陷是引起化疗药耐受的主要原因之一。程序性坏死（Necroptosis）是由RIPK1、RIPK3和MLKL介导的一种不依赖于Caspase的死亡方式。由于程序性坏死使用与细胞凋亡不同的信号通路，因此肿瘤细胞对促凋亡药物耐受，对促程序性坏死药物不一定耐受，且Caspase缺陷后反而会增强程序性坏死。ABIN-1是一种泛素结合蛋白，可以与泛素编辑酶A20相互作用，在细胞死亡和炎症调节中发挥重要作用。我们已知ABIN-1蛋白可参与正常细胞的程序性坏死的调控，然而对肿瘤细胞特别是结肠癌细胞发生的程序性坏死是否具有调控作用尚不明确。本实验室前期研究发现ABIN-1缺陷可增强TNFα+Birinapant+IDN-6556诱导的程序性坏死，而对非TNFα介导的程序性坏死是否具有调节作用尚需进一步研究。本研究揭示了一种新的低毒高效的程序性坏死诱导剂Poly(I:C)+5Z-7-Oxozeaenol+IDN-6556 (P5I) ，且在体外、体内证实敲低ABIN-1能够增强结肠癌细胞对程序性坏死诱导剂P5I的敏感性。本文的研究结果为结肠癌治疗提供了新思路。
方法：
1. 通过Western Blot检测凋亡和程序性坏死通路中重要的分子标志，确定Poly(I:C)联合5Z-7-Oxozeaenol（TAK1抑制剂）在HaCaT和COLO205细胞中能否诱发细胞凋亡和程序性坏死。
2. 运用基于慢病毒系统的Abin-1 shRNA感染HaCaT和COLO205细胞，经嘌呤霉素筛选5天，获得ABIN-1敲低的稳转细胞。在细胞死亡诱导剂P5（Poly(I:C)+5Z-7-Oxozeaenol）和P5I的作用下，通过Western Blot技术检测凋亡和程序性坏死通路中重要的关键蛋白。3. 通过siRNA干扰技术，在HaCaT和COLO205细胞中下调ABIN-1蛋白的表达，在程序性坏死诱导剂P5I刺激下，通过Western Blot技术检测程序性坏死通路中的关键蛋白。
4. 利用ToxiLight细胞毒性分析试剂盒，检测在死亡诱导剂P5、P5I的刺激下，比较敲低ABIN-1的结肠癌细胞与野生型细胞上清中腺苷酸激酶（AK）的释放情况，分析细胞死亡情况；并确定该死亡是否可被RIPK1抑制剂Nec-1s或MLKL抑制剂NSA阻断。
5. 利用ABIN-1敲低的稳转结肠癌细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型，腹腔注射药物，研究ABIN-1缺陷的肿瘤对促程序性坏死治疗是否更为敏感。
6. 运用qPCR技术和Western Blot技术检测TLR3的表达，探究ABIN-1蛋白调控Poly(I:C)介导的程序性坏死的可能机制。
结果：
1. HaCaT和COLO205细胞在P5的刺激下，出现Caspase-3、PARP-1的剪切（细胞凋亡的标志）。HaCaT和COLO205细胞在P5联合IDN-6556（caspase-8抑制剂）的刺激下，出现RIPK1、MLKL磷酸化（程序性坏死的标志），并能被RIPK1抑制剂Nec-1s抑制。
2. 与野生型细胞相比，ABIN-1敲低的结肠癌细胞在死亡诱导剂P5的作用下，出现更强的Caspase-3和PARP-1剪切；在死亡诱导剂P5I的作用下，出现更强的RIPK1、MLKL的磷酸化，并可被Nec-1s抑制。
3. 与野生型细胞相比，ABIN-1敲低的结肠癌细胞在P5、P5I的刺激下，细胞死亡明显增加， Nec-1s或者NSA可抑制P5I诱发的细胞死亡。
4. 裸鼠皮下移植瘤模型揭示，在程序性坏死诱导剂P5I的作用下，ABIN-1敲低组肿瘤比对照组肿瘤显著缩小；Western Blot检测结果显示，P5I在ABIN-1敲低的肿瘤中可诱导更强的程序性坏死标志物的表达。
5. HaCaT和COLO205细胞在程序性坏死诱导剂P5I的作用下，ABIN-1敲低细胞与野生型细胞相比，TLR3的mRNA和蛋白的表达水平均有明显升高。
结论：
1. P5能够诱导HaCaT和COLO205细胞发生凋亡；P5联合caspase-8抑制剂可诱导细胞发生程序性坏死。
2. ABIN-1在poly(I:C)介导的程序性坏死中起重要的调节作用。体外或体内模型均证明，敲低ABIN-1能够显著增强结肠癌细胞对poly(I:C)介导的程序性坏死的敏感性。
3. 敲低ABIN-1增敏poly(I:C)介导的程序性坏死的主要机制是增强了P5I诱导的TLR3表达。
结肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，其发病率高、死亡率高、预后差。结肠癌在临床上主要采用以5-氟尿嘧啶为核心的化疗方案，但不少病人在治疗的初期或治疗一段时间后出现药物耐受，这严重限制了化疗药的应用。促凋亡信号通路的缺陷是引起化疗药耐受的主要原因之一。程序性坏死（Necroptosis）是由RIPK1、RIPK3和MLKL介导的一种不依赖于Caspase的死亡方式。由于程序性坏死使用与细胞凋亡不同的信号通路，因此肿瘤细胞对促凋亡药物耐受，对促程序性坏死药物不一定耐受，且Caspase缺陷后反而会增强程序性坏死。ABIN-1是一种泛素结合蛋白，可以与泛素编辑酶A20相互作用，在细胞死亡和炎症调节中发挥重要作用。我们已知ABIN-1蛋白可参与正常细胞的程序性坏死的调控，然而对肿瘤细胞特别是结肠癌细胞发生的程序性坏死是否具有调控作用尚不明确。本实验室前期研究发现ABIN-1缺陷可增强TNFα+Birinapant+IDN-6556诱导的程序性坏死，而对非TNFα介导的程序性坏死是否具有调节作用尚需进一步研究。本研究揭示了一种新的低毒高效的程序性坏死诱导剂Poly(I:C)+5Z-7-Oxozeaenol+IDN-6556 (P5I) ，且在体外、体内证实敲低ABIN-1能够增强结肠癌细胞对程序性坏死诱导剂P5I的敏感性。本文的研究结果为结肠癌治疗提供了新思路。
方法：
1. 通过Western Blot检测凋亡和程序性坏死通路中重要的分子标志，确定Poly(I:C)联合5Z-7-Oxozeaenol（TAK1抑制剂）在HaCaT和COLO205细胞中能否诱发细胞凋亡和程序性坏死。
2. 运用基于慢病毒系统的Abin-1 shRNA感染HaCaT和COLO205细胞，经嘌呤霉素筛选5天，获得ABIN-1敲低的稳转细胞。在细胞死亡诱导剂P5（Poly(I:C)+5Z-7-Oxozeaenol）和P5I的作用下，通过Western Blot技术检测凋亡和程序性坏死通路中重要的关键蛋白。3. 通过siRNA干扰技术，在HaCaT和COLO205细胞中下调ABIN-1蛋白的表达，在程序性坏死诱导剂P5I刺激下，通过Western Blot技术检测程序性坏死通路中的关键蛋白。
4. 利用ToxiLight细胞毒性分析试剂盒，检测在死亡诱导剂P5、P5I的刺激下，比较敲低ABIN-1的结肠癌细胞与野生型细胞上清中腺苷酸激酶（AK）的释放情况，分析细胞死亡情况；并确定该死亡是否可被RIPK1抑制剂Nec-1s或MLKL抑制剂NSA阻断。
5. 利用ABIN-1敲低的稳转结肠癌细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型，腹腔注射药物，研究ABIN-1缺陷的肿瘤对促程序性坏死治疗是否更为敏感。
6. 运用qPCR技术和Western Blot技术检测TLR3的表达，探究ABIN-1蛋白调控Poly(I:C)介导的程序性坏死的可能机制。
结果：
1. HaCaT和COLO205细胞在P5的刺激下，出现Caspase-3、PARP-1的剪切（细胞凋亡的标志）。HaCaT和COLO205细胞在P5联合IDN-6556（caspase-8抑制剂）的刺激下，出现RIPK1、MLKL磷酸化（程序性坏死的标志），并能被RIPK1抑制剂Nec-1s抑制。
2. 与野生型细胞相比，ABIN-1敲低的结肠癌细胞在死亡诱导剂P5的作用下，出现更强的Caspase-3和PARP-1剪切；在死亡诱导剂P5I的作用下，出现更强的RIPK1、MLKL的磷酸化，并可被Nec-1s抑制。
3. 与野生型细胞相比，ABIN-1敲低的结肠癌细胞在P5、P5I的刺激下，细胞死亡明显增加， Nec-1s或者NSA可抑制P5I诱发的细胞死亡。
4. 裸鼠皮下移植瘤模型揭示，在程序性坏死诱导剂P5I的作用下，ABIN-1敲低组肿瘤比对照组肿瘤显著缩小；Western Blot检测结果显示，P5I在ABIN-1敲低的肿瘤中可诱导更强的程序性坏死标志物的表达。
5. HaCaT和COLO205细胞在程序性坏死诱导剂P5I的作用下，ABIN-1敲低细胞与野生型细胞相比，TLR3的mRNA和蛋白的表达水平均有明显升高。
结论：
1. P5能够诱导HaCaT和COLO205细胞发生凋亡；P5联合caspase-8抑制剂可诱导细胞发生程序性坏死。
2. ABIN-1在poly(I:C)介导的程序性坏死中起重要的调节作用。体外或体内模型均证明，敲低ABIN-1能够显著增强结肠癌细胞对poly(I:C)介导的程序性坏死的敏感性。
3. 敲低ABIN-1增敏poly(I:C)介导的程序性坏死的主要机制是增强了P5I诱导的TLR3表达。