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背景
心血管疾病（Cardiovascular diseases，CVD）是主要的非传染性致死疾病，糖尿病患者心血管疾病风险增加，并且较非糖尿病患者发病时间提前14.6年，而2型糖尿病（T2DM）的患病率正在逐年提高，成为威胁人类健康的主要疾病之一。动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）是T2DM患者致死和致残的主要原因，其中包括冠心病、缺血性卒中及外周动脉疾病。加强T2DM患者的综合管理能够最大限度降低心血管事件和死亡风险，改善预后，提高患者生活质量。此外，针对T2DM合并ASCVD患者使用具有明确心血管获益的降糖药干预也具有至关重要的作用[1]。
阿卡波糖(Acarbose)是一种 α-葡萄糖苷酶抑制剂，作为临床常见降糖药用于控制餐后血糖。研究发现阿卡波糖可不通过降低血糖的方式靶向Ras信号途径抑制血管平滑肌细胞的迁移和增殖，从而减少ASCVD相关危险事件的发生[2]。此外，阿卡波糖可通过调节血清游离脂肪酸和胰岛素样生长因子-1的水平间接改善糖耐量减低时的大血管病变[3]。其对T2DM小鼠创面愈合和血管生成有促进作用，并对内皮祖细胞功能有一定改善作用[4]。这些体内外实验均提示阿卡波糖具有独立于降糖功能的直接血管保护作用。目前有关临床研究观察阿卡波糖的心血管保护作用尚存在争议。因此，本课题旨在研究阿卡波糖对血管内皮细胞功能的影响，并进一步探讨其中潜在的作用机制。
炎症可导致血管内皮功能障碍和动脉粥样硬化的形成和发展[5]，NLRP3炎性小体是近年来炎症研究中的新发现。NLRP3 炎性小体作为一种蛋白质复合物，由三种蛋白寡聚化形成，它们分别是Nod样受体蛋白（NLRP3）和凋亡相关斑点样蛋白（ASC）以及半胱天冬氨酸酶（Caspase-1）[6]。在无激活物质存在时，NLRP3的LRR结构域与NOD结构域结合，抑制自身的寡聚化而处于无活性状态[7]。活性氧（ROS）被认为是由ATP和颗粒物质触发NLRP3炎性小体激活的上游共同细胞信号，NLRP3炎性小体的激活能被ROS清除剂和NADPH oxidase抑制剂阻断[8]。活化的Caspase-1参与IL-1β的加工和成熟[6,9,10]，IL-1β作为一种炎症介质，能够作用于血管内皮细胞，降低血管内皮细胞间紧密连接和黏附连接的粘附强度, 促进了细胞收缩和血管内皮细胞间裂隙的形成，导致血管通透性增加[11,12]。
已有既往研究发现，阿卡波糖能降低T2DM患者外周血单核细胞转录因子核因子κB（NF-κB）的活性[13]。另外，阿卡波糖还可通过AMPK-NO-RAS信号通路抑制高胆固醇导致的血管炎症[14]。同时，本课题前期实验结果提示阿卡波糖能抑制高糖导致的NLRP3炎性小体形成和激活，其中，Western blot及ELISA结果显示阿卡波糖能显著抑制高糖导致NLRP3蛋白表达增多、IL-1β活性增高，然而，阿卡波糖能否通过抑制NLRP3炎性小体的形成来改善糖尿病导致的血管内皮功能障碍仍需进一步明确。因此，我们假设NLRP3炎性小体的激活能够破坏血管内皮细胞通透性，而阿卡波糖通过抑制NLRP3炎性小体降低血管内皮细胞高通透性，从而改善糖尿病血管功能；而阿卡波糖抑制NLRP3炎性小体的机制与抑制NADPH oxidase依赖的活性氧产生有关。本研究为临床上选择具有明确心血管获益证据的降糖药物提供实验理论依据，同时也为糖尿病心血管并发症的防治提供新的药物靶点。
目的
由于2型糖尿病（T2DM）常合并心血管事件，寻找具有明确心血管获益的降糖药就显得尤为重要。阿卡波糖是一种抑制餐后高血糖的α-葡萄糖苷酶抑制剂，目前研究结果显示其具有潜在的抗炎作用，通过这种作用能否对心血管起保护作用仍存在争议。NLRP3炎性小体激活介导的血管内皮细胞间紧密连接断裂，是导致糖尿病内皮屏障功能障碍的标志性事件。本研究拟探究阿卡波糖通过抑制 T2DM 血管内皮细胞 NLRP3 炎性小体激活，对血管内皮屏障功能障碍的保护作用及具体机制。
研究方法
1. 用高糖（HG，30mM）体外分别培养大鼠主动脉内皮细胞（RAECs）24、48、72h，同时，选用不同浓度（1、3、9μM）阿卡波糖分别处理正常培养的RAECs, 采用MTT法检测不同时间高糖和不同浓度阿卡波糖对细胞增殖及生存率的影响；用ELISA法筛选出高糖和阿卡波糖处理细胞的最适作用时间与浓度；通过Western blot、ELISA、共聚焦荧光显微镜观察高糖及阿卡波糖对细胞NLRP3炎性小体激活的影响。
2. 采用高糖、阿卡波糖、NADPH氧化酶抑制剂apocynin（Apo 10μM）、Nox4 siRNA处理RAECs, 通过荧光探针DHE荧光光谱法检测细胞内超氧阴离子生成；Western blot分别检测Nox1、Nox2以及Nox4的蛋白表达水平；Nox4 siRNA转染RAECs后，应用RT-PCR技术检测其中可能参与作用的Nox4 mRNA水平。
3. 采用高糖、Nox4 siRNA处理RAECs, 运用Western Blot分析细胞裂解液中NLRP3和p20/pro-Caspase-1的蛋白表达，ELISA试剂盒检测细胞培养上清液中Caspase-1活性和IL-1β的产生，共聚焦荧光显微镜观察胞质区NLRP3和ASC的共定位。
4. 采用高糖、阿卡波糖、NLRP3 siRNA、NLRP3炎性小体特异性抑制剂（MCC950） 10μM处理RAECs, 通过Western Blot分析其中紧密连接蛋白ZO-1和粘附连接蛋白VE-Cadherin的表达；流式细胞术检测细胞膜ZO-1蛋白表达水平；运用Transwell小室法检测单层内皮FITC葡聚糖漏出的荧光强度。
5. 建立T2DM大鼠模型，采用阿卡波糖（30mg/kg/d，i.g）、MCC950（3mg/kg/d，i.p）干预5周后，检测大鼠血清中FBG、HOMA-IR及OGTT血糖值；ELISA法测定大鼠血清中丙二醛（MDA）和IL-1β的含量；采用静脉注射伊文思蓝染料法，定量观察伊文思蓝染料从血浆中向间质渗漏的情况；分离大鼠完整的胸主动脉，血管张力实验分别检测Ach（1×10-9-10-5M）和SNP（1×10-9-10-5M）对血管的舒张反应；同时，体外用葡萄糖（50mM，3.5h）孵育大鼠胸主动脉，应用新型特异性Nox4抑制剂GKT137831处理大鼠主动脉环，检测Ach（1×10-9-10-5M）和SNP（1×10-9-10-5M）对血管的舒张反应；应用免疫组织化学法检测血管ZO-1和VE-Cadherin 的荧光表达；使用激光共聚焦显微镜观察大鼠主动脉内皮 Nox4/vWF、NLRP3/ASC、NLRP3/vWF、Caspase-1/vWF的荧光共定位。
研究结果
1. MTT实验结果显示，相比于正常对照组，高糖24、48h，阿卡波糖1、3μM处理RAECs对细胞增殖及生存率的影响无统计学差异（P＞0.05）；ELISA 结果提示，相较于正常组，高糖处理RAECs 24h显著增加IL-1β的产生（P＜0.05），且高于48h刺激结果，3μM阿卡波糖干预高糖处理的RAECs后，与高糖组相比能明显降低IL-1β的产生（P＜0.05）；选用阿卡波糖3μM和高糖处理24h进行后续的实验，Western blot、ELISA、共聚焦荧光显微镜检测结果提示高糖组相比于正常组明显促进NLRP3、p20的蛋白表达（P＜0.05），增加Caspase-1的活性和IL-1β的产生（P＜0.05），明显提高NLRP3/ASC的荧光共聚焦效率（P＜0.05），而相对于高糖组，阿卡波糖干预组能显著逆转以上高糖刺激的影响（P＜0.05）。
2. DHE荧光光谱法检测结果显示，高糖组相比于正常对照组红色荧光光密度值明显增高，阿卡波糖干预组显著降低了高糖对荧光强度的影响（P＜0.05），此作用与Apo干预效果一致；Western blot及RT-PCR实验结果提示，与正常对照组相比，高糖组显著增加Nox4蛋白和mRNA水平（P＜0.05），相对于高糖组，阿卡波糖干预组明显降低Nox4表达（P＜0.05），而针对Nox1和Nox2蛋白表达并没有显著的抑制作用（P＞0.05）。Nox4 siRNA转染RAECs后，RT-PCR结果提示其转染效率相比于正常对照组有统计学意义（P＜0.05）；DHE荧光法结果显示Nox4 siRNA转染能明显降低高糖所致的红色荧光光密度值增高（P＜0.05）。
3. Western Blot结果显示，Nox4 siRNA转染能明显抑制高糖导致的NLRP3和p20蛋白表达增加（P＜0.05）；相对于高糖组，ELISA结果提示Nox4 siRNA组显著降低Caspase-1的活性和IL-1β的产生，共聚焦荧光显示Nox4 siRNA转染明显降低NLRP3/ASC的荧光共聚焦效率（P＜0.05）。
4. Western Blot结果显示，与正常对照组相比，高糖显著降低细胞ZO-1和VE-Cadherin的蛋白表达水平，而阿卡波糖、MCC950或NLRP3 siRNA可明显逆转高糖的此种作用（P＜0.05）；流式细胞术结果提示阿卡波糖显著改善高糖导致的细胞膜ZO-1蛋白降低（P＜0.05）；Transwell小室法检测结果提示高糖显著增加了内皮细胞单层的相对通透性，阿卡波糖、MCC950或NLRP3 siRNA明显降低高糖所致的通透性（P＜0.05）。
5. 体内实验中，相比于T2DM大鼠，阿卡波糖干预5周后， FBG、HOMA-IR及OGTT血糖值均明显下降（P＜0.05）；ELISA结果显示阿卡波糖和MCC950处理可显著减轻T2DM大鼠体内 MDA 和 IL-1β 的升高（P＜0.05）；定量观察伊文思蓝染料渗漏结果提示，阿卡波糖和MCC950能显著降低T2DM大鼠模型组的染料渗漏吸光值（P＜0.05）；血管张力实验显示，与正常对照组相比，Ach 针对 T2DM 大鼠内皮依赖性血管舒张反应明显受损，阿卡波糖和MCC950治疗5周后能显著改善这种现象（P＜0.05），SNP导致的血管舒张反应在各组间无明显差异（P＞0.05）；体外实验GKT137831处理能有效改善高糖环境下大鼠主动脉针对Ach的血管舒张功能（P＜0.05），SNP导致的血管舒张反应在各组间无明显差异（P＞0.05）。T2DM大鼠主动脉内皮Nox4/vWF、NLRP3/ASC、NLRP3/vWF、Caspase-1/vWF的荧光共定位效率明显增加，阿卡波糖能显著抑制这种变化（P＜0.05）。
结论
1. 阿卡波糖抑制高糖诱导的大鼠主动脉内皮细胞NLRP3炎性小体活化。
2. 阿卡波糖通过降低Nox4依赖性活性氧抑制NLRP3炎性小体激活。
3. 阿卡波糖通过抑制 Nox4/NLRP3 炎性小体通路逆转高糖导致的大鼠主动脉内皮细胞屏障功能障碍。
4. 阿卡波糖通过抑制NLRP3炎性小体改善T2DM大鼠血管通透性，增强内皮依赖性血管舒张功能。
心血管疾病（Cardiovascular diseases，CVD）是主要的非传染性致死疾病，糖尿病患者心血管疾病风险增加，并且较非糖尿病患者发病时间提前14.6年，而2型糖尿病（T2DM）的患病率正在逐年提高，成为威胁人类健康的主要疾病之一。动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）是T2DM患者致死和致残的主要原因，其中包括冠心病、缺血性卒中及外周动脉疾病。加强T2DM患者的综合管理能够最大限度降低心血管事件和死亡风险，改善预后，提高患者生活质量。此外，针对T2DM合并ASCVD患者使用具有明确心血管获益的降糖药干预也具有至关重要的作用[1]。
阿卡波糖(Acarbose)是一种 α-葡萄糖苷酶抑制剂，作为临床常见降糖药用于控制餐后血糖。研究发现阿卡波糖可不通过降低血糖的方式靶向Ras信号途径抑制血管平滑肌细胞的迁移和增殖，从而减少ASCVD相关危险事件的发生[2]。此外，阿卡波糖可通过调节血清游离脂肪酸和胰岛素样生长因子-1的水平间接改善糖耐量减低时的大血管病变[3]。其对T2DM小鼠创面愈合和血管生成有促进作用，并对内皮祖细胞功能有一定改善作用[4]。这些体内外实验均提示阿卡波糖具有独立于降糖功能的直接血管保护作用。目前有关临床研究观察阿卡波糖的心血管保护作用尚存在争议。因此，本课题旨在研究阿卡波糖对血管内皮细胞功能的影响，并进一步探讨其中潜在的作用机制。
炎症可导致血管内皮功能障碍和动脉粥样硬化的形成和发展[5]，NLRP3炎性小体是近年来炎症研究中的新发现。NLRP3 炎性小体作为一种蛋白质复合物，由三种蛋白寡聚化形成，它们分别是Nod样受体蛋白（NLRP3）和凋亡相关斑点样蛋白（ASC）以及半胱天冬氨酸酶（Caspase-1）[6]。在无激活物质存在时，NLRP3的LRR结构域与NOD结构域结合，抑制自身的寡聚化而处于无活性状态[7]。活性氧（ROS）被认为是由ATP和颗粒物质触发NLRP3炎性小体激活的上游共同细胞信号，NLRP3炎性小体的激活能被ROS清除剂和NADPH oxidase抑制剂阻断[8]。活化的Caspase-1参与IL-1β的加工和成熟[6,9,10]，IL-1β作为一种炎症介质，能够作用于血管内皮细胞，降低血管内皮细胞间紧密连接和黏附连接的粘附强度, 促进了细胞收缩和血管内皮细胞间裂隙的形成，导致血管通透性增加[11,12]。
已有既往研究发现，阿卡波糖能降低T2DM患者外周血单核细胞转录因子核因子κB（NF-κB）的活性[13]。另外，阿卡波糖还可通过AMPK-NO-RAS信号通路抑制高胆固醇导致的血管炎症[14]。同时，本课题前期实验结果提示阿卡波糖能抑制高糖导致的NLRP3炎性小体形成和激活，其中，Western blot及ELISA结果显示阿卡波糖能显著抑制高糖导致NLRP3蛋白表达增多、IL-1β活性增高，然而，阿卡波糖能否通过抑制NLRP3炎性小体的形成来改善糖尿病导致的血管内皮功能障碍仍需进一步明确。因此，我们假设NLRP3炎性小体的激活能够破坏血管内皮细胞通透性，而阿卡波糖通过抑制NLRP3炎性小体降低血管内皮细胞高通透性，从而改善糖尿病血管功能；而阿卡波糖抑制NLRP3炎性小体的机制与抑制NADPH oxidase依赖的活性氧产生有关。本研究为临床上选择具有明确心血管获益证据的降糖药物提供实验理论依据，同时也为糖尿病心血管并发症的防治提供新的药物靶点。
目的
由于2型糖尿病（T2DM）常合并心血管事件，寻找具有明确心血管获益的降糖药就显得尤为重要。阿卡波糖是一种抑制餐后高血糖的α-葡萄糖苷酶抑制剂，目前研究结果显示其具有潜在的抗炎作用，通过这种作用能否对心血管起保护作用仍存在争议。NLRP3炎性小体激活介导的血管内皮细胞间紧密连接断裂，是导致糖尿病内皮屏障功能障碍的标志性事件。本研究拟探究阿卡波糖通过抑制 T2DM 血管内皮细胞 NLRP3 炎性小体激活，对血管内皮屏障功能障碍的保护作用及具体机制。
研究方法
1. 用高糖（HG，30mM）体外分别培养大鼠主动脉内皮细胞（RAECs）24、48、72h，同时，选用不同浓度（1、3、9μM）阿卡波糖分别处理正常培养的RAECs, 采用MTT法检测不同时间高糖和不同浓度阿卡波糖对细胞增殖及生存率的影响；用ELISA法筛选出高糖和阿卡波糖处理细胞的最适作用时间与浓度；通过Western blot、ELISA、共聚焦荧光显微镜观察高糖及阿卡波糖对细胞NLRP3炎性小体激活的影响。
2. 采用高糖、阿卡波糖、NADPH氧化酶抑制剂apocynin（Apo 10μM）、Nox4 siRNA处理RAECs, 通过荧光探针DHE荧光光谱法检测细胞内超氧阴离子生成；Western blot分别检测Nox1、Nox2以及Nox4的蛋白表达水平；Nox4 siRNA转染RAECs后，应用RT-PCR技术检测其中可能参与作用的Nox4 mRNA水平。
3. 采用高糖、Nox4 siRNA处理RAECs, 运用Western Blot分析细胞裂解液中NLRP3和p20/pro-Caspase-1的蛋白表达，ELISA试剂盒检测细胞培养上清液中Caspase-1活性和IL-1β的产生，共聚焦荧光显微镜观察胞质区NLRP3和ASC的共定位。
4. 采用高糖、阿卡波糖、NLRP3 siRNA、NLRP3炎性小体特异性抑制剂（MCC950） 10μM处理RAECs, 通过Western Blot分析其中紧密连接蛋白ZO-1和粘附连接蛋白VE-Cadherin的表达；流式细胞术检测细胞膜ZO-1蛋白表达水平；运用Transwell小室法检测单层内皮FITC葡聚糖漏出的荧光强度。
5. 建立T2DM大鼠模型，采用阿卡波糖（30mg/kg/d，i.g）、MCC950（3mg/kg/d，i.p）干预5周后，检测大鼠血清中FBG、HOMA-IR及OGTT血糖值；ELISA法测定大鼠血清中丙二醛（MDA）和IL-1β的含量；采用静脉注射伊文思蓝染料法，定量观察伊文思蓝染料从血浆中向间质渗漏的情况；分离大鼠完整的胸主动脉，血管张力实验分别检测Ach（1×10-9-10-5M）和SNP（1×10-9-10-5M）对血管的舒张反应；同时，体外用葡萄糖（50mM，3.5h）孵育大鼠胸主动脉，应用新型特异性Nox4抑制剂GKT137831处理大鼠主动脉环，检测Ach（1×10-9-10-5M）和SNP（1×10-9-10-5M）对血管的舒张反应；应用免疫组织化学法检测血管ZO-1和VE-Cadherin 的荧光表达；使用激光共聚焦显微镜观察大鼠主动脉内皮 Nox4/vWF、NLRP3/ASC、NLRP3/vWF、Caspase-1/vWF的荧光共定位。
研究结果
1. MTT实验结果显示，相比于正常对照组，高糖24、48h，阿卡波糖1、3μM处理RAECs对细胞增殖及生存率的影响无统计学差异（P＞0.05）；ELISA 结果提示，相较于正常组，高糖处理RAECs 24h显著增加IL-1β的产生（P＜0.05），且高于48h刺激结果，3μM阿卡波糖干预高糖处理的RAECs后，与高糖组相比能明显降低IL-1β的产生（P＜0.05）；选用阿卡波糖3μM和高糖处理24h进行后续的实验，Western blot、ELISA、共聚焦荧光显微镜检测结果提示高糖组相比于正常组明显促进NLRP3、p20的蛋白表达（P＜0.05），增加Caspase-1的活性和IL-1β的产生（P＜0.05），明显提高NLRP3/ASC的荧光共聚焦效率（P＜0.05），而相对于高糖组，阿卡波糖干预组能显著逆转以上高糖刺激的影响（P＜0.05）。
2. DHE荧光光谱法检测结果显示，高糖组相比于正常对照组红色荧光光密度值明显增高，阿卡波糖干预组显著降低了高糖对荧光强度的影响（P＜0.05），此作用与Apo干预效果一致；Western blot及RT-PCR实验结果提示，与正常对照组相比，高糖组显著增加Nox4蛋白和mRNA水平（P＜0.05），相对于高糖组，阿卡波糖干预组明显降低Nox4表达（P＜0.05），而针对Nox1和Nox2蛋白表达并没有显著的抑制作用（P＞0.05）。Nox4 siRNA转染RAECs后，RT-PCR结果提示其转染效率相比于正常对照组有统计学意义（P＜0.05）；DHE荧光法结果显示Nox4 siRNA转染能明显降低高糖所致的红色荧光光密度值增高（P＜0.05）。
3. Western Blot结果显示，Nox4 siRNA转染能明显抑制高糖导致的NLRP3和p20蛋白表达增加（P＜0.05）；相对于高糖组，ELISA结果提示Nox4 siRNA组显著降低Caspase-1的活性和IL-1β的产生，共聚焦荧光显示Nox4 siRNA转染明显降低NLRP3/ASC的荧光共聚焦效率（P＜0.05）。
4. Western Blot结果显示，与正常对照组相比，高糖显著降低细胞ZO-1和VE-Cadherin的蛋白表达水平，而阿卡波糖、MCC950或NLRP3 siRNA可明显逆转高糖的此种作用（P＜0.05）；流式细胞术结果提示阿卡波糖显著改善高糖导致的细胞膜ZO-1蛋白降低（P＜0.05）；Transwell小室法检测结果提示高糖显著增加了内皮细胞单层的相对通透性，阿卡波糖、MCC950或NLRP3 siRNA明显降低高糖所致的通透性（P＜0.05）。
5. 体内实验中，相比于T2DM大鼠，阿卡波糖干预5周后， FBG、HOMA-IR及OGTT血糖值均明显下降（P＜0.05）；ELISA结果显示阿卡波糖和MCC950处理可显著减轻T2DM大鼠体内 MDA 和 IL-1β 的升高（P＜0.05）；定量观察伊文思蓝染料渗漏结果提示，阿卡波糖和MCC950能显著降低T2DM大鼠模型组的染料渗漏吸光值（P＜0.05）；血管张力实验显示，与正常对照组相比，Ach 针对 T2DM 大鼠内皮依赖性血管舒张反应明显受损，阿卡波糖和MCC950治疗5周后能显著改善这种现象（P＜0.05），SNP导致的血管舒张反应在各组间无明显差异（P＞0.05）；体外实验GKT137831处理能有效改善高糖环境下大鼠主动脉针对Ach的血管舒张功能（P＜0.05），SNP导致的血管舒张反应在各组间无明显差异（P＞0.05）。T2DM大鼠主动脉内皮Nox4/vWF、NLRP3/ASC、NLRP3/vWF、Caspase-1/vWF的荧光共定位效率明显增加，阿卡波糖能显著抑制这种变化（P＜0.05）。
结论
1. 阿卡波糖抑制高糖诱导的大鼠主动脉内皮细胞NLRP3炎性小体活化。
2. 阿卡波糖通过降低Nox4依赖性活性氧抑制NLRP3炎性小体激活。
3. 阿卡波糖通过抑制 Nox4/NLRP3 炎性小体通路逆转高糖导致的大鼠主动脉内皮细胞屏障功能障碍。
4. 阿卡波糖通过抑制NLRP3炎性小体改善T2DM大鼠血管通透性，增强内皮依赖性血管舒张功能。