尼古丁是烟草中生产过程中主要的有毒生物碱,是一种环境中广泛存在的N-杂环污染物,对生态环境以及人类健康有着极大的危害。弯曲假单胞菌N1是本实验新筛选到的一株具有高效降解尼古丁能力的微生物,其代谢途径为吡啶-吡咯混合途径。吡啶-吡咯混合途径是近些年来发现的一种新的尼古丁微生物降解途径,该途径以已报道的吡啶途径以及吡咯途径为基础,吡啶途径的上游与吡咯途径的下游交叉形成。目前,相较于吡啶途径以及吡咯途径的研究,混合途径的分子机理研究尚处于浅显的程度。因此,对弯曲假单胞菌N1的尼古丁代谢机理研究,有助于加深对尼古丁代谢分子机理的理解,为深入解析吡啶-吡咯混合途径打下基础。本文的研究基于实验室筛选到的尼古丁高效降解菌株弯曲假单胞菌N1。通过中间代谢产物的检测,N1菌株降解途径被确认为吡啶-吡咯混合途径。通过全基因组测序,运用生物信息学进行分析、挖掘基因组信息,分离鉴定得到多个尼古丁降解相关基因。荧光定量PCR分析了多个尼古丁降解相关基因在有无尼古丁诱导下的转录差异,确定了相关基因在尼古丁诱导下的转录上调。综合基因组信息与RTqPCR,初步确定N1菌株的尼古丁代谢基因簇,对相关基因进行体外表达予以验证途径。经过体外验证,证实基因hisD是吡啶-吡咯混合途径的关键基因,催化该途径的交叉反应。hisD基因催化6-Hydroxypseudooxynicotine(6HPON)转化为6-Hydroxy-3-succinoylpyridine(HSP),连接吡啶上游途径与吡咯下游途径。hisD基因在大肠杆菌中表达没有功能,在恶臭假单胞菌KT2440中催化反应,显示hisD基因编码的蛋白需要其他辅因子的共同作用。vD基因催化HSP转化为2,5-Dihydroxy-pyridine(2,5-DHP),该反应是混合途径下游的第一个反应,与吡咯途径相似。该基因可以在大肠杆菌中大量表达,蛋白的生化性质研究显示了其快速反应的能力。