论文部分内容阅读
为了研究甲状旁腺素相关肽(Parathyroidhormonerelatedprotein,PTHrP)核定位序列(nuclear localization sequence,NLS)和C-末端缺失对小鼠脊髓氧化应激的影响,我们采用Karaplis等利用基因工程构建的PTHrP Knock-In(KI)小鼠,简称KI小鼠(通过在小鼠PTHrP基因第84位氨基酸序列后敲入(Knock-In)氨基酸翻译的终止密码子TGA,建立一个只表达PTHrP1-84而不表达NLS和C末端的小鼠模型),通过组织学、分子生物学、基因芯片检测等方法,比较分析了出生后3天、7天与14天(P3,P7,P14)野生型(wild type,WT)和KI小鼠脊髓氧化应激及DNA损伤的差异。首先,为了明确PTHrP NLS与C末端缺失是否造成小鼠脊髓氧化-抗氧化系统的失衡,加剧DNA损伤,从而影响脊髓发育,我们取生后7天的PTHrP KI及同窝WT小鼠脊髓组织,行流式细胞术检测脊髓活性氧簇ROS含量;生物化学试剂盒检测抗氧化酶指标包括总超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的表达;免疫组化染色检测P3,P7,P14PTHrP KI及同窝WT小鼠脊髓DNA损伤指标8羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG)的表达;免疫印迹实验(western blot)检测P7,P14 PTHrP KI及同窝WT小鼠脊髓的DNA损伤标记蛋白包括磷酸化细胞周期检测点激酶2(p-chk2)及γ-H2AX(组蛋白H2A的特殊变异体)的蛋白表达变化。结果显示P7的KI小鼠来源的脊髓组织的抗氧化酶SOD,CAT,GSH-PX的表达均低于WT小鼠,而ROS则高于WT对照;P3,P7,P14的KI小鼠来源的脊髓8-OH-dG的表达均高于野生型小鼠,且P7的KI小鼠来源的脊髓组织p-chk2及γ-H2AX的蛋白表达均高于WT对照。结果提示PTHrP NLS与C末端缺失可导致脊髓组织氧化应激增强,抗氧化能力下降,DNA损伤加剧,从而影响脊髓发育。为进一步明确PTHrP NLS与C末端缺失造成脊髓氧化-抗氧化系统的失衡,加剧DNA损伤的机制,并寻找其中的关键通路及信号因子,我们饲养如下两组孕鼠:1)PTHrPKI杂合子孕鼠,给予添加抗氧化剂-吡咯喹啉醌(PQQ)喂养;2)PTHrPKI杂合子孕鼠,常规喂养。收集出生后7天的PTHrPKI小鼠与同窝WT对照小鼠,取脊髓,分为四组:a)PTHrPKI+PQQ喂养(孕鼠及哺乳期母鼠持续喂养);b)PTHrPKI+常规喂养;c)WT+PQQ喂养(孕鼠及哺乳期母鼠持续喂养);d)WT+常规喂养;每组设4个样本,共16个样本。委托南京苏博生物科技有限公司,行mRNA与LncRNA测序,并对进一步分析与氧化应激、DNA损伤及细胞周期相关的LncRNA及mRNA的变化。首先,16个脊髓样本由南京苏博生物科技有限公司经Ambion mirVana miRNA Isolation Kit 提取总 RNA 并鉴定符合条件后,采用 CapitalBio Technology Mouse LncRNA Array v1.0检测芯片进行RNA微阵列芯片杂交及获取原始信号图像文件。对所获得信号图片数据,采用Feature Extraction软件进行预处理分析,再导入GeneSpring软件,对芯片原始数据进行汇总、归一化和质控。筛选差异表达转录本,将基于筛选所得的差异表达基因进行蛋白互作网络分析,以探求差异表达基因网络中的枢纽基因。然后,基于cytohubba筛选枢纽基因,基于GSEA进行KEGG通路富集分析。同时,对3组动物(WT+正常饮食,KI+正常饮食,KI+PQQ)共12个样本的mRNA表达谱数据进行主成分分析(PCA),以从组学角度探究饮食添加PQQ能否纠正PTHrP NLS及C末端缺失所致小鼠脊髓抗氧化应激能力的改变。数据分析结果如下:首先,我们梳理PTHrPKI及WT组小鼠脊髓mRNA筛出的DEG,得到54个上调,51个下调的mRNA。继而我们提取这些mRNA对应的归一化的数据,并利用R做层次聚类,制作热图。通过对PTHrPKI及野生型小鼠表达谱进行GSEA富集分析,我们筛选出与PTHrP KI表型有显著关联的通路。按照NES绝对值排序,列出与PTHrP KI表型最为负相关的5个KEGG通路。结果显示:细胞增殖相关通路,例如Cell cycle(细胞周期),DNA replication(DNA复制),Nucleotide excision repair(核苷酸剪切修复)和 Mismatch repair(错配修复),均与PTHrP KI呈负性关联。通过采用cytoscape v3.5.1对网络进行可视化,利用插件cytohubba对ppi网络中的hub-gene进行计算,寻找到差异表达基因中的10个枢纽基因(Ccna2,Ccnb1,Cdk1,Kifl1,Pbk,Bub1,Prc1,Mki67,Rrm2,Shcbp1)及其临接基因。根据ARCH4数据库的注释及文献查阅,我们发现:这10个枢纽基因均与细胞增殖关系密切。鉴于Ccna2,Ccnb1,Cdk1为排序前三的关键基因,且均与增殖凋亡密切相关,因此我们对这三个基因进行关键lncRNA的筛选,在lncRNA-mRNA共表达网络的基础上,我们对皮尔逊相关系数绝对值大于0.9的lncRNA-mRNA对进行筛选,并取三个基因的交集,得到与三个关键基因Ccna2,Ccnb1,Cdk1都相关的9条lncRNA。通过数据分析,所获得的关键差异基因相关的9条lncRNA中,仅有2条表达上调,其余7条表达均下调。在KI小鼠脊髓中显著上升,同时PQQ补充后显著下降的lncRNA仅有NONMMUT006126;在KI小鼠脊髓中显著下降,同时PQQ补充后显著上升的lncRNA仅有NONMMUT064530。由于前者NONMMUT006126的本底表达值过低,而后者NONMMUT064530的本底表达值较高。且根据NONCODE数据库的数据,可见NONMMUT064530具有组织表达特异性,在脑内海马区具有高表达。因此,我们初步选定NONMMUT064530作为我们下一步验证的目标lncRNA。同时,为分析饮食添加抗氧化剂PQQ能否纠正或部分纠正因PTHrPNLS与C末端缺失对小鼠脊髓发育造成的影响。我们对KI小鼠,WT小鼠,及KI+PQQ小鼠的数据进行主成分分析。结果显示,应用PQQ纠正治疗的Pthrp KI小鼠对应的数据点大多与野生型小鼠对应的数据点汇聚在一处;而未进行PQQ纠正治疗的KI小鼠对应的数据点则汇聚在另一处,与WT及PQQ治疗组有显著区别。此结果可辅助说明抗氧化剂PQQ对由于PTHrP NLS与C末端缺失对小鼠脊髓发育造成的影响具有挽救作用,提示PTHrPKI小鼠的脊髓发育障碍与氧化应激损伤有关。上述结果进一步从生物信息学角度说明PTHrP NLS与C末端缺失可影响小鼠脊髓的增殖能力与氧化应激反应。提示PTHrP KI小鼠的脊髓发育障碍与氧化应激损伤有关。同时,关键mRNA及lncRNA的获取,也为后续进行real time RT-PCR验证,鉴定检测相关通路关键信号分子提供了生物信息数据基础。综上所述,本研究结果证明PTHrP NLS和C末端缺失可上调小鼠脊髓ROS的表达,下调细胞抗氧化酶SOD1、GPX1、CAT的表达;上调8-OH-dG的表达,下调p-chk2及γ-H2AX的表达。降低了脊髓的抗氧化能力,加剧了 DNA损伤反应,从而影响了脊髓的发育。生物信息学分析提示NONMMUT064530可能起了重要的介导作用,且PQQ对由于PTHrP NLS与C末端缺失对小鼠脊髓发育造成的影响具有挽救作用。本研究结果初步提示PTHrP NLS和C末端可增加脊髓的抗氧化应激能力,减少DNA损伤,可为将PTHrP NLS和C末端开发为新的治疗脊髓损伤的靶标提供了初步的实验依据。