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寨卡病毒(ZIKV)是一种通过蚊媒传播的黄病毒,与格林-巴利综合征(GBS)、小头畸形等严重的神经系统并发症异常相关。尽管对ZIKV感染人类细胞分子机制的研究日益深入,但是决定ZIKV复制及免疫相关的宿主因子,仍亟待挖掘。NS5蛋白是ZIKV最大且最保守的非结构蛋白,具有多种酶活性和功能,在病毒复制和免疫逃逸中发挥重要作用。ZIKV在复制过程中,NS5蛋白具有定位于细胞核的典型特征,但其在细胞核内与宿主蛋白相互作用的分子细节仍不清楚。本研究通过免疫沉淀实验和质谱分析方法,筛选了与ZIKV NS5蛋白相互作用的宿主蛋白,并对宿主蛋白HNRNPA2B1与ZIKV NS5的相互作用关系及其功能机制展开深入地解析,具体内容和结果如下:1.ZIKV NS5和宿主相互作用蛋白的筛选与验证在HEK-293T细胞中,通过在免疫沉淀实验后进行质谱分析,筛选出可能与ZIKV NS5发生互作的一系列宿主蛋白。然后进一步根据其功能及在细胞中的定位,选取核不均一核糖核蛋白A2/B1(HNRNPA2B1)进行互作验证。免疫共沉淀实验(Co-IP)、双分子荧光互补系统(Bi FC)以及免疫荧光分析的结果表明,ZIKV NS5蛋白可以和宿主HNRNPA2B1蛋白在细胞核内共定位并且发生相互作用。2.ZIKV NS5和HNRNPA2B1之间相互作用的关键区域根据NS5和HNRNPA2B1的结构域,分别构建这两个蛋白的不同截短质粒,将其转染HEK-293T细胞后,通过Co-IP和Bi FC实验,确定二者发生相互作用的具体区域,Western Blot和间接免疫荧光结果显示,ZIKV NS5 MTase结构域可以与HNRNPA2B1的RRM1、RRM2及GRD结构域均发生相互作用。3.HNRNPA2B1蛋白对ZIKV复制的影响运用CRISPR-Cas9技术将HEK-293T和JEG3细胞系的HNRNPA2B1基因敲除,并构建相应稳定细胞系。随后在寨卡病毒感染细胞后,收集不同时间点样品分别用于q RT-PCR,Western Blot和空斑实验,检测病毒复制水平和增殖滴度。结果显示,敲除HNRNPA2B1显著抑制了ZIKV RNA的复制和NS5蛋白生成,而HNRNPA2B1的过表达则可促进病毒的复制和蛋白质的生成。说明HNRNPA2B1具有促进ZIKV复制的功能。4.HNRNPA2B1与NS5相互作用影响ZIKV复制的分子机制研究Western Blot和IFA实验验证了HNRNPA2B1可以上调细胞核内ZIKV NS5的表达并且能够通过阻止溶酶体降解NS5来促进其稳定性,表明HNRNPA2B1通过与ZIKV NS5互作来促进其在细胞核中发挥相应功能,从而影响病毒复制。综上所述,本研究表明,宿主HNRNPA2B1是影响ZIKV复制的关键因子,并且ZIKV NS5与HNRNPA2B1的相互作用为开发抗ZIKV治疗方法提供了新的有利信息。