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目的:基因工程菌——rBCG-hIFN-a-2b真空冷冻干燥保存的可行性研究,探索冷冻干燥工艺参数,为临床提供易保存、易运输、稳定、安全的冻干重组BCG疫苗。本课题着重比较分析了真空冷冻干燥法对重组BCG的活菌数、形态、生长曲线、外源性蛋白—人干扰素-a-2b的表达情况的影响,研究冷冻干燥过程对基因工程菌——rBCG-hIFN-a-2b中质粒基因稳定性的影响。并且研究rBCG-hIFN-a-2b的生物安全性问题。 方法:采用真空冷冻干燥法保存rBCG-hIFN-a-2b,筛选最佳工艺参数,绘制冷冻干燥曲线。用平板计数法比较冷冻干燥前后rBCG-hIFN-a-2b的活菌数,计算存活率。抗酸染色后显微镜下比较分析冻干前后rBCG-hIFN-a-2b的形态。连续测定冻干前、后重组BCG的OD值,绘制生长曲线。在24孔板中加入含卡那霉素的Middlebrook 7H9,分别扩增培养冻干后rBCG-hIFN-a-2b单克隆菌落,然后用PCR方法扩增hIFN-a-2b的基因片断,1%琼脂糖凝胶电泳,用上述方法来分析基因工程菌——rBCG-hIFN-a-2b质粒的稳定性。用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定冻干前后rBCG表达外源性蛋白——IFN-a-2b的情况。8只结核菌素试验阴性的豚鼠,皮下接种冻干前后重组BCG,观察其精神状态、活动、体重变化,六周后解剖,肉眼观察各脏器,做组织病理切片、HE染色、镜检。 结果:筛选出合适的冻干参数,成功制备了冻干重组BCG菌苗。冻干前活菌数为1×10~7cfu/ml,冻干后活菌数为6.5×10~6cfu/ml,存活率为65%左右。冻干前后重组BCG形态、生长率无明显变化。48个冻干重组BCG单克隆菌落中,有4个单菌落出现卡那霉素抗性丢失现象,保留卡那霉素抗性的44个单菌落中,随机取5个经PCR均可检测到IFN-a-2b基因片断,因此质粒保留率为91.7%,质粒脱失率为8.3%。ELISA测定冻干前后相同OD值rBCG-hlFN-a-2b分泌IFN-a-2b的量没有明显差别。皮下注射冻干前、后重组BCG,豚鼠未出现精神、活动异常,而且体重明显增加。解剖各脏器肉眼均