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氧化锰是地壳中丰富的具有高反应活性的金属矿物,而微生物的氧化作用被认为是环境锰氧化物形成的主要成因,其中以细菌的锰氧化作用最受关注。已知锰氧化细菌广泛分布于海水及其海底沉积物、淡水水体和土壤等多种环境中,其中以厚壁菌、放线菌和变形菌门细菌(α-,β-,和γ-纲)是主要的锰氧化细菌种类。尽管目前国内外对海洋细菌的锰氧化机制进行了较为深入的探索,但对土壤锰氧化细菌种类及其锰氧化机制却缺乏研究。本研究以一株实验室分离的土栖性大肠杆菌MB266为研究对象,在确定该菌株具有高锰氧化活性的基础上,通过Real time-qPCR分析锰氧化活性基因和对特定功能基因进行基因敲除等途径对该菌的锰氧化作用机制进行了研究。根据文献报道的各种细菌锰氧化基因和对大肠杆菌基因组序列比对分析,确定了38个可能的锰氧化基因,通过设计特定引物用Real-time-qPCR技术来分析MB266菌株中这些基因在有Mn(Ⅱ)诱导和无Mn(Ⅱ)诱导条件下不同生长时期转录活性的变化。结果发现其中的15个基因在菌体不同生长时期转录活性发生明显变化,且在对数期后期和在添加Mn(Ⅱ)诱导条件下基因转录活性上调。基于在Mn(Ⅱ)诱导条件下转录活性变化较大和其编码产物为细胞内氧化还原酶的属性,本研究选择其中的转录活性上调的多酮氧化酶mco266基因和转录活性下调的过氧化氢酶基因katE作为目标基因,用Red重组系统进行了基因敲除和缺陷菌株和野生菌株锰氧化活性的对比分析；对转录活性明显上调的细胞壁电子传递体细胞色素C基因(ccmF, ccmFGH)与mco266进行了体外共表达和锰氧化活性分析。以野生菌MB266为出发菌株,分别敲除多酮氧化酶基因mco266和过氧化氢酶基因katE,获得基因缺陷菌株MB267和MB279。对比测定缺陷菌和野生菌MB266的锰氧化活性,发现mco266缺陷菌(MB267)的锰氧化活性比野生菌株降低29.82%,而katE缺陷菌MB269锰氧化活性无明显变化；进一步以MB267为出发菌株来敲除过氧化氢酶基因katE,发现mco266和katE双缺陷菌株的锰氧化活性对比MB267没有明显变化,进行katE基因表达的补偿实验,亦发现表达补偿重组菌的锰氧化活性无变化。这些结果表明,多铜氧化酶基因mco266为MB266菌株的锰氧化基因之一,但明显并非是唯一锰氧化功能基因。从MB266菌株中分别扩增细胞色素C基因ccmF和基因组合ccmFGH,分别与mco266基因一起连接于大肠杆菌表达载体pTrcHis-C,获得相应共表达重组质粒后,再导入无锰氧化活性的大肠杆菌受体菌JM109,分别得到重组菌MB275和MB271。测定重组菌的锰氧化活性,得到重组菌MB257和MB271的锰氧化率(%)分别为3.90州和4.13 μM。结果表明多铜氧化酶MC0266可与细胞色素c蛋白共同作用完成锰氧化作用。