论文部分内容阅读
目的肝脏纤维化(hepatic fibrosis HF)的特征改变是肝脏内细胞外基质(extracellularmatrix ECM)的过度沉积,其中心环节是肝星状细胞(hepatic stallate cell HSC)的活化。HSC是细胞外基质的主要来源,HSC还可分泌TIMPs使ECM的降解减少,导致ECM合成与分解的不平衡进一步促进了肝纤维化的形成。另一方面ECM也通过某些机制影响着HSC。在HF过程中正常的基底膜样细胞外基质被以Ⅰ型及Ⅲ型胶原为主的纤维型基质所替代,这一改变不仅引起肝脏结构的改变,更重要的是可以使HSC激活并维持其活化状态。炎性因子在纤维化疾病中起到重要作用,已有研究表明TNF-α可以诱导包埋于Ⅰ型胶原的皮肤成纤维细胞pro-MMP-2的活化,单独的Ⅰ型胶原或TNF-α对成纤维细胞pro-MMP-2的活化作用不大,IL1介导的培养于Ⅰ型胶原的HSC的活化需要MMPs的参与,单独的IL1或Ⅰ型胶原的作用都不会引起MMPs的产生及HSC的活化,TNF-α作为一种重要的炎性因子其在促HSC活化中是否需要其它因素的介导还不清楚。另外干扰素作为一种抗纤维化药物被广泛应用于临床,在临床应用中发现在肝脏处于炎症活动的患者效果好于非炎症活动期的患者,干扰素是否通过抗炎性因子发挥其抗纤维化作用还不清楚。本研究通过观察TNF-α、Ⅰ型胶原、IFN-α对体外培养的HSC分泌Ⅰ型胶原(Col-I)、MMP-2 mRNA、MMP-14 mRNA及MMP-2蛋白表达的影响,来阐述HSC活化及IFN-α抗肝纤维化的部分作用机制,为临床肝纤维化的药物治疗提供更多的理论依据。材料与方法1.(1)材料:大鼠肝星状细胞株(r-HSC99)(2)主要试剂:干扰素-α-2b(IFN-α2b);肿瘤坏死因子-α(TNF-α);鼠尾胶、Ⅰ型胶原(Col-I)、MMP-2、MMP-14引物;兔抗鼠MMP-2抗体、兔抗鼠β-actin抗体、山羊抗兔抗体。2.方法:体外培养大鼠肝星状细胞系rHSC-99,分别用TNF-α,Ⅰ型胶原,TNF-α和Ⅰ型胶原,TNF-α、Ⅰ型胶原和IFN-α-2b作用4、12、24、36小时,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定各组HSC细胞Col-I mRNA,MMP-2、14mRNA表达,采用半定量的方法计算出各组的相对含量,应用western blotting方法检测各组HSC细胞活化MMP-2蛋白的表达。3.统计学处理:应用SPSS软件对数据进行方差分析。实验结果1、各时间点不同干预组对HSC表达Col-I mRNA的影响:Ⅰ型胶原组Col-ImRNA表达水平均较正常对照组明显增高,经方差分析,差异有统计学意义(P＜0.05);TNF-α组与正常对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05),TNF-α、Ⅰ型胶原和IFN-α2b组Col-I mRNA表达水平较TNF-α和Ⅰ型胶原组降低,差异有统计学意义(P＜0.05),TNF-α和Ⅰ型胶原组较Ⅰ型胶原Col-I mRNA表达水平升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。2、各时间点不同干预组对HSC表达MMP-2mRNA的影响:TNF-α和Ⅰ型胶原组MMP-2 mRNA表达水平均较正常对照组增高,经方差分析,差异有统计学意义(P＜0.05);TNF-α组、Ⅰ型胶原组较正常对照组差异无统计学意义(P＞0.05),TNF-α、Ⅰ型胶原和IFN-α2b组MMP-2 mRNA表达水平较TNF-α和Ⅰ型胶原组有降低,经方差分析,差异有统计学意义(P＜0.05)。3、各时间点不同干预组对HSC表达MMP-14 mRNA的影响:TNF-α和Ⅰ型胶原组MMP-14 mRNA表达水平均较正常对照组增高,经方差分析,差异有统计学意义(P＜0.05);TNF-α组、Ⅰ型胶原组较正常对照组差异无统计学意义(P＞0.05),TNF-α、Ⅰ型胶原和IFN-α2b组MMP-14 mRNA表达水平较TNF-α和Ⅰ型胶原组降低,经方差分析,差异有统计学意义(P＜0.05)。4、24h各组MMP-2蛋白表达的结果显示:Ⅰ型胶原和TNF-α组与Ⅰ型胶原组均可见活化的MMP-2蛋白表达,IFN-α、TNF-α和Ⅰ型胶原组无活化的MMP-2蛋白表达。结论1、Ⅰ型胶原可促进HSC的Col-I mRNA的表达;单独的TNF-α对HSC表达Col-I mRNA没有明显的促进作用。Ⅰ型胶原和TNF-α共同作用可显著增强Ⅰ型胶原促进HSC表达Col-I mRNA的作用。2、Ⅰ型胶原与TNF-α共同作用可促进HSC的MMP-2 mRNA表达,单独的TNF-α或Ⅰ型胶原对HSC的MMP-2 mRNA表达没有明显的促进作用。Ⅰ型胶原可促进HSC的活化的MMP-2蛋白的表达,单独的TNF-α无此作用。3、Ⅰ型胶原与TNF-α共同作用可促进HSC的MMP-14 mRNA的表达;单独的TNF-α或Ⅰ型胶原对HSC的MMP-14 mRNA的表达没有明显的促进作用。4、IFN-α可抑制Ⅰ型胶原与TNF-α共同作用引起的HSC的Col-I mRNA、MMP-2 mRNA、MMP-14 mRNA的表达及Ⅰ型胶原引起的HSC活化的MMP-2蛋白的表达。这可能是IFN-α发挥抗肝纤维化作用的途径之一。