丝氨酸蛋白酶是多种寄生虫的消化酶,在寄生虫的发育和生存过程中,除了具有催化和蛋白加工的功能外,还在寄生虫成囊、组织侵袭、营养摄取、免疫逃避和致病性等方面起重要作用。旋毛虫丝氨酸蛋白酶（Trichinella spiralis serine protease,TsSP,Genbank:ABY60762）在旋毛虫侵入宿主小肠上皮细胞（IECs）,幼虫发育中亦可能发挥了重要作用。旋毛虫谷胱甘肽S-转移酶（T.spiralis glutathione-S-transferase,TsGST,Genbank:XM＿003373603.1）在旋毛虫生活史各期均有表达,主要定位在虫体的皮层、杆状体和生殖原基,抗r TsGST免疫血清对体外幼虫侵入IEC具有显著的抑制作用,表明TsGST参与了幼虫的侵入。该文应用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术对TsSP和TsGST基因的功能进行了研究,观察了RNAi对TsSP和TsGST酶活性的影响,进一步观察了RNAi对幼虫的侵袭、发育能力和生殖力的影响。根据这2种基因的mRNA序列设计小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）,利用电穿孔法将siRNA转染到幼虫体内,通过qPCR和Western blot分别在基因转录和蛋白表达调查RNAi对基因的沉默效果。应用明胶酶谱和降解底物试验观察RNAi对肌幼虫虫体可溶蛋白和排泄分泌（ES）蛋白中天然TsSP和TsGST的酶活性。体外实验观察RNAi对幼虫侵入IEC和小肠黏膜的影响。通过动物实验观察TsSP和TsGST基因沉默对幼虫的侵袭、发育能力及生殖力的抑制作用。材料与方法1.旋毛虫虫种、小鼠及细胞旋毛虫（Trichinella spiralis,T1）在本实验室BALB/c小鼠中传代保种。BALB/c雌性小鼠购自河南省实验动物中心。小鼠肠上皮细胞由本实验室从正常小鼠小肠分离培养,并用于体外旋毛虫幼虫-细胞侵袭模型。2.TsSP和TsGST的诱导表达及其抗血清的制备将本实验室构建的TsSP和TsGST重组菌活化,诱导表达并纯化r TsSP和r TsGST蛋白,用于免疫小鼠,获得抗r TsSP和r TsGST的免疫血清。3.siRNA的设计与合成根据TsSP和TsGST的mRNA序列,用siDirect version2.0在线工具设计siRNA。依据筛选的每条siRNA,根据其siRNA靶向位点分别命名为TsSP特异性siRNA-156、siRNA-171和siRNA-436,以及TsGST特异性siRNA-366。同时,设计1条control siRNA并加FAM荧光标记,用作阴性对照和观察siRNA是否旋毛虫体内。4.电穿孔法将siRNA转染到旋毛虫体内电穿孔法将1.0μM siRNA导入到旋毛虫肌幼虫体内后,体外培养18h后荧光显微镜下观察siRNA是否进入幼虫体内。5.RNAi对基因在转录和表达水平的影响通过qPCR和Western blot技术确定TsSP-siRNA的最佳干扰效果,从1.5、2.0、2.5、3.0和3.5μM siRNA得到最好的干扰剂量,将siRNA转染幼虫1、3、5和7 d后,观察RNAi对TsSP基因在转录和蛋白表达的沉默效果。观察TsGST-siRNA在不同浓度（1.5、2.0、2.5和3.0μM siRNA）与转染不同时间（1、2、3、4和5 d）后,最佳对TsGST基因的沉默效果。6.RNA干扰基因的特异性分别将TsSP-siRNA和TsGST-siRNA利用电穿孔法导入到旋毛虫体内后,互为对照,分析RNAi对2种基因特异性沉默的特异性。7.TsSP和TsGST基因沉默对其酶活性的影响通过明胶酶谱法和降解丝氨酸特异性底物偶氮酪蛋白,观察TsSP-siRNA对TsSP酶活性的影响。应用谷胱甘肽S转移酶底物CDNB观察TsGST-siRNA对TsGST酶活性的影响。8.RNAi对幼虫存活率及侵入IEC的影响将siRNA转染到肌幼虫后,体外培养7d,观察肌幼虫形态的变化,并计算幼虫的存活率。将RNAi后体外培养1d的幼虫经5%胆汁激活为肠道感染性1期幼虫（IIL1）,然后再将100条IIL幼虫与半固体培养基混匀后接种到体外培养的IEC单层上,孵育2h后观察并计数侵入IECs的幼虫数。9.RNAi对幼虫侵入小肠黏膜的影响将RNAi后体外培养1d的100条幼虫,注射入离体的2cm长的小肠袋内,37℃、5%CO₂孵育2h后,剪开小肠,观察并计数幼虫对肠粘膜的侵入率。10.RNAi对旋毛虫幼虫在小鼠体内的侵入、发育和生殖力的抑制将80只BALB/c小鼠等分为4组（20只/组）,分别为TsSP-siRNA干扰组,TsGST-siRNA干扰组,control siRNA组和PBS空白对照组。每组每只小鼠径口感染300条siRNA转染后的肌幼虫。感染6d后每组剖杀10只小鼠,回收肠道期成虫（AW）,计算成虫减虫率,分别选取10条雌成虫在37℃、5%CO₂体外培养72h收集新生幼虫（NBL）,计数NBL并拍照,计算雌成虫生殖力。剩余小鼠在感染后35d,麻醉后处死小鼠,收集肌幼虫（ML）,计算每克肌肉组织的肌幼虫虫数和幼虫减虫率。同时观察各期虫体形态并测量长度。结果1.FAM荧光信号追踪siRNA导入到肌幼虫体内后,荧光显微镜下观察到虫体内有绿色荧光。2.RNAi对TsSP和TsGST基因转录和蛋白表达水平的下调2.1 RNAi对TsSP基因转录和蛋白表达的抑制作用:qPCR和Western blot结果表明,siRNA-156、siRNA-171和siRNA-436实验组的TsSP转录水平相对于PBS组分别降低了50.54%、36.36%（P<0.05）和13.41%。同PBS组相比TsSP蛋白表达量分别减少了54.55%、46.84%和30.06%（P<0.05）。siRNA-156在1.5、2.0、2.5、3.0和3.5μM时,TsSP在转录水平相对于PBS组分别减少了50.4 9%、51.49%、55.48%、50.14%和48.47%（P<0.05）,TsSP在蛋白表达水平相对于PBS组分别减少49.62%、44.38%、58.6%、51.91%和54.38%（P<0.05）。2.5μM siRNA-156在转染后1、3、5和7 d,TsSP基因在转录水平上相对于PBS组分别减少了59.98%、37.23%、36.22%和8.71%（P<0.05）。TsSP在蛋白表达水平上相对于PBS分别减少了48.35%、36.68%、35.01%和21.7 5%（P<0.05）。Control siRNA组相对于PBS组的差异无统计学意义（P>0.05）。2.2 siRNA-366对TsGST基因转录和蛋白表达水平的抑制作用:qPCR和Western blot结果表明,siRNA-366在1.5、2.0、2.5和3.0μM时,TsGST在转录水平相对于PBS组分别减少了19.53%、20.24%、21.39%和49.38%（P<0.05）。Control siRNA组相对于PBS组的差异无统计学意义（P<0.05）。TsGST在蛋白水平相对于PBS组分别减少了40.36%、41.59%、46.42%和59.18%（P<0.05）。Control siRNA与PBS组的差异无统计学意义（P>0.05）。应用3.0μM siRNA-366在转染1、2、3、4和5 d,TsGST基因在转录水平上相对于PBS组分别减少了49.09%、32.65%、15.46%、12.62%和12.14%（P<0.05）;TsGST在蛋白水平上相对于PBS组分别减少了65.22%、41.00%、19.11%、12.97%和1.97%（P<0.05）。Control siRNA组相对于PBS组的差异无统计学意义（P>0.05）。3.RNA干扰基因特异性分析利用电穿孔法将siRNA导入到旋毛虫肌幼虫体内培养1 d。TsSP-siRNA-156处理组TsSP表达水平降低了57.10%（P<0.05）而TsGST蛋白表达水平无明显变化（P>0.05）,TsGST-siRNA-366处理组TsGST表达水平降低了56.09%（P<0.05）而TsSP蛋白表达水平无显著性变化（P>0.05）。4.RNAi对酶活性的抑制作用4.1 RNAi对TsSP酶活性的抑制作用:明胶酶谱分析显示,2.5μM siRNA-156处理后使肌幼虫的ES蛋白降解明胶的能力明显低于control siRNA和PBS组。通过降解偶氮酪蛋白来检测siRNA-156处理后的TsSP酶活性。在siRNA-156处理组、control siRNA和PBS对照组中,相对于PBS组,siRNA-156处理组的肌幼虫ES蛋白中TsSP降解偶氮酪蛋白的酶活性降低了61.38%（F=1570.157,P<0.05）。4.2 RNAi对TsGST酶活性的抑制作用:酶活性分析表明,在siRNA-366组,TsGST催化还原性谷胱甘肽结合CDNB的酶活性为0.55±0.35 U/mg蛋白,在control siRNA组为0.94±0.12 U/mg蛋白,PBS组为1.00±0.078 U/mg蛋白。siRNA-366组和PBS组之间,TsGST的酶活性的差异有统计学意义（F=18.063,P=0.003）。control siRNA组和PBS对照组酶活性的差异无统计学意义（P=0.445）。结果表明,siRNA-366干扰可降低幼虫的TsGST的酶活性。5.RNAi后虫体存活率RNAi后培养1 d,siRNA-156、control siRNA和PBS组幼虫的死亡率分别是4.67%、4.33%和3.33%（P>0.05）,培养7d后,siRNA-156、control siRNA和PBS组幼虫的死亡率分别是33.33%、32.00%和31.67%（P>0.05）。结果表明,应用siRNA-156后幼虫的存活率无明显变化。RNAi后培养1 d,siRNA-366、control siRNA和PBS组幼虫的死亡率分别是4.33%、4.00%和3.67%（P>0.05）,培养7d后,siRNA-366、control siRNA和PBS组幼虫的死亡率分别是35.67%、34.33%和32.33%（P>0.05）。结果表明,siRNA-366幼虫的存活率无明显变化。6.RNAi对幼虫侵入IEC的抑制6.1 siRNA-156对幼虫体外侵入IEC的抑制作用:将IIL1接种到IEC单层上并培养2 h,IIL1侵入并在细胞单层中迁移。siRNA-156组的幼虫侵入率（40.90%）显着低于control siRNA组（65.76%）和PBS组（64.47%）（χ²=20.999,P<0.0001）。结果表明,siRNA-156下调TsSP基因可明显抑制IIL1对IEC的侵入。6.2 siRNA-366对TsGST的沉默抑制幼虫侵入IEC:将IIL1幼虫添加到IEC单层并培养2 h后,IIL1侵入IECs并在IEC单层中迁移。siRNA-366组的幼虫侵入率（42.93%）显着低于control siRNA（64.33%）和PBS组（65.20%）（χ²=10.502,P<0.05）。与PBS组相比,siRNA-366对幼虫的侵袭具有明显的抑制作用,抑制率为34.16%。Control siRNA与PBS对照组侵入率的差异无统计学意义（χ²=0.10,P>0.05）。7.RNA干扰对幼虫侵袭小肠黏膜的抑制7.1 siRNA-156对幼虫侵袭离体小肠黏膜的抑制作用:将IIL1灌注到小肠腔中并与Tyrode溶液孵育2 h后,幼虫侵入肠粘膜。siRNA-156、control siRNA和PBS对照组的幼虫侵袭率分别为51.00%、68.00%和69.00%（χ²=8.748,P=0.013<0.05）。结果表明,与PBS相比,siRNA-156对幼虫侵入肠粘膜的抑制率为26.09%。7.2 siRNA-366对幼虫侵入离体小肠黏膜的抑制:注射经siRNA处理的IIL1并在小肠中孵育,培养2 h后,IILI侵入肠粘膜。结果表明,siRNA-366实验组的幼虫侵入率为36.00%,control siRNA对照组的幼虫侵入率为56.00%,PBS组的侵入率为58.00%。siRNA-366处理组的幼虫侵入率明显低于control siRNA组和PBS对照组（χ²=11.840,P<0.05）。8.RNAi对幼虫在小鼠体内的侵入、发育和生殖力的抑制8.1 TsSP基因沉默对幼虫的侵入、发育和生殖力的抑制:与PBS对照组相比,siRNA-156组的成虫和肌幼虫减虫率分别为是58.85%和60.48%。siRNA-156处理幼虫攻击感染6 d,siRNA-156组的成虫荷（49.91±6.47）明显低于control siRNA组（120.64±9.71）和PBS组（121.27±8.96）(F_adults=256.630,P<0.05),siRNA-156实验组雌成虫所产新生幼虫数量（60.78±6.01）条,明显低于control siRNA对照组的（87.94±5.88）条和PBS组的（87.47±4.85）条(F_NBL=50.440,P<0.05)条。siRNA-156转染幼虫攻击感染小鼠后35 d,肌幼虫荷（1245.736±248.0253）明显低于control siRNA组（2942.374±245.7014）和PBS组（3152.836±565.38）的肌幼虫荷(F _larvea=81.877,P<0.05)。测量旋毛虫各期虫体长度,siRNA-156组的雌成虫长度（2076.51±420.98）μm明显低于control siRNA对照组（2489.28±374.71）μm和PBS组（2437.34±270.93）μm(F_{f AW}=5.817,P<0.05);siRNA-156组的雄成虫长度（930.67±88.92）μm明显低于control siRNA组（1159.60±220.53）μm和PBS组（1191.67±138.93）μm(F_{m AW}=9.617,P<0.05)。siRNA-156组的新生幼虫长度（87.694±19.34）μm低于control siRNA对照组（103.5±12.05）μm和PBS组（110.52±10.72）μm(F_NBL=9.753,P<0.05)。siRNA-156组的肌幼虫长度（923.54±115.61）μm低于control siRNA组（1144.54±114.14）μm和PBS组（1125.24±80.90）μm(F_ML=40.933,P<0.05)。8.2 TsGST基因沉默对幼虫的侵入、发育和生殖力的抑制:与PBS对照组相比,siRNA-366组的成虫和肌幼虫减虫率分别是62.82%和65.07%。siRNA-366处理幼虫攻击感染小鼠后6 d,siRNA-366组的成虫数（45.09±7.45）明显低于control siRNA组（120.64±9.71）和PBS组（121.27±8.96）(F_adults=15642.775,P<0.05)。siRNA-366实验组雌成虫的新生幼虫产量（58.31±5.60）条,明显低于control siRNA组的（87.94±5.88）条和PBS组的（87.47±4.85）条（F=89.133,P<0.05）。siRNA-366处理幼虫攻击感染小鼠后35 d,肌幼虫数（1101.268±144.5001）,低于control siRNA组（2942.374±245.7014）和PBS组（3152.836±565.38）虫数(F_larvea=105.050,P<0.05)。siRNA-366组的雌成虫长度（1949.96±326.75）μm明显低于control siRNA对照组（2489.28±374.71）μm和PBS（2437.34±270.93）μm(F_{f AW}=12.425,P<0.05);siRNA-366组的雄成虫长度（1019.82±74.222）μm明显低于control siRNA对照（1159.60±220.53）μm和PBS组（1191.67±138.93）μm(F_{m AW}=4.095,P<0.05)。siRNA-366组的新生幼虫长度（87.77±16.19）μm低于control siRNA组（103.5±12.05）μm和PBS组（110.592±10.72）μm(F_NBL=11.751,P<0.05)。siRNA-366组的肌幼虫长度（910.01±119.80）μm低于control siRNA对照组（1144.54±114.14）μm和PBS组（1125.24±80.90）μm(F_ML=44.961,P<0.05)。结论1.应用电穿孔法成功将TsSP和TsGST的特异性siRNA导入到旋毛虫肌幼虫体内。2.siRNAs下调TsSP和TsGST的转录和蛋白表达水平,并抑制了其酶活性。3.TsSP和TsGST基因沉默显著性抑制了旋毛虫幼虫对小肠上皮细胞和肠黏膜的侵入以及虫体发育,并降低了雌虫生殖力。4.TsSP和TsGST在旋毛虫侵入、发育和生殖等方面发挥了重要作用,可作为抗旋毛虫疫苗潜在的分子靶标。