【摘 要】
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目的:肝纤维化是由多种致病因素所导致的肝内结缔组织异常增生,并且最终可向肝硬化发展,而肝硬化可导致肝癌,是一种严重威胁人类健康的疾病。抑制肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）的激活以及增殖,同时促进活化HSCs的表型转换与凋亡,是目前抗肝纤维化的重要治疗策略。细胞自噬是使HSCs保持在活化状态的一个重要因素。白介素10（Interleukin 10,IL-10）抗纤
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目的:肝纤维化是由多种致病因素所导致的肝内结缔组织异常增生,并且最终可向肝硬化发展,而肝硬化可导致肝癌,是一种严重威胁人类健康的疾病。抑制肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）的激活以及增殖,同时促进活化HSCs的表型转换与凋亡,是目前抗肝纤维化的重要治疗策略。细胞自噬是使HSCs保持在活化状态的一个重要因素。白介素10（Interleukin 10,IL-10）抗纤维化形成的作用十分显著。本研究拟探讨Akt/mTOR/STAT3信号通路在白介素10调节细胞自噬中的作用机制,希望为肝纤维化防治提供新的根据。方法:（1）过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）的细胞自噬诱导作用:不同浓度H2O2诱导大鼠肝星状细胞（HSC-T6）和人肝星状细胞（HSC-LX2）,建立细胞自噬模型,Cell Counting Kit-8（CCK-8）、乳酸脱氢酶（LDH）试验检测H2O2干预后细胞的生存率与死亡率,Western Blot检测自噬相关蛋白LC3I、LC3II的表达。（2）IL-10对H2O2诱导的HSCs自噬的调控作用:不同浓度IL-10干预H2O2诱导自噬的HSCs,Western Blot检测自噬相关蛋白LC3I与LC3II的表达,免疫荧光与透射电镜检测细胞内自噬小体数量。（3）Akt/mTOR/STAT3通路在IL-10调控H2O2诱导HSCs自噬中的作用:IL-10干预经H2O2诱导自噬的HSCs,并通过mTOR抑制剂雷帕霉素和STAT3抑制剂隐丹参酮处理HSCs以阻断mTOR和STAT3的磷酸化作用。Western Blot检测各组HSCs自噬相关蛋白LC3I、LC3II、Akt/mTOR/STAT3通路相关蛋白p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、p-STAT3（Y705）、STAT3的表达变化。免疫荧光、透射电镜检测各组细胞内自噬小体数量变化。评估Akt/mTOR/STAT3通路在IL-10调控H2O2诱导HSCs自噬中的作用。结果:（1）成功构建H2O2诱导HSCs自噬模型:CCK-8、LDH检测不同浓度H2O2干预24 h后HSCs的存活率与死亡率。结果表明,H2O2干预浓度为100μmol/L以下时,不会对HSC-T6细胞产生过大毒性导致细胞损伤及死亡;H2O2浓度为500μmol/L以下时,不会对HSC-LX2细胞产生过大毒性导致细胞损伤及死亡。Western Blot分析表明100μmol/L H2O2连续干预HSCs时,HSC-T6细胞自噬相关蛋白LC3II/I比值在干预3 h后升高,而HSC-LX2细胞的LC3II/I比值则在干预后6 h升高。自噬抑制剂3-MA可减少H2O2诱导的HSCs自噬,降低LC3II/I比值。（2）IL-10对H2O2诱导的HSCs自噬的抑制作用:不同浓度IL-10与100μmol/L H2O2联合干预HSCs,Western Blot结果显示IL-10浓度为10 ng/m L时细胞自噬相关蛋白LC3II/I比值较H2O2组下降。细胞免疫荧光结果显示,H2O2干预可诱导HSCs自噬小体数量增加;IL-10干预可减少H2O2诱导的HSCs自噬小体形成。透射电子显微镜结果证实,H2O2可诱导HSC-T6细胞发生自噬,IL-10干预可减少H2O2诱导的HSC-T6细胞自噬小体数量。（3）Akt/mTOR/STAT3通路在IL-10调控H2O2诱导的自噬中的作用:Western Blot检测有无IL-10干预的HSCs自噬,结果显示,H2O2组p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p-STAT3（Y705）/STAT3表达均下降;IL-10干预可上调H2O2诱导的HSCs的p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p-STAT3（Y705）/STAT3表达。mTOR特异性抑制剂雷帕霉素可抑制IL-10对mTOR及其下游分子STAT3的磷酸化的激动作用并降低IL-10对H2O2诱导的HSCs自噬的抑制作用;细胞免疫荧光与透射电镜证实雷帕霉素可阻断IL-10对H2O2诱导的HSCs胞浆内自噬小体形成的抑制作用。STAT3特异性抑制剂隐丹参酮可抑制IL-10对STAT3磷酸化的激动作用从而阻断IL-10对H2O2诱导的HSCs细胞自噬的抑制作用,细胞免疫荧光与透射电镜也进一步证实阻断STAT3磷酸化后细胞内自噬小体数量增多。结论:（1）H2O2可以诱导HSCs发生自噬,成功构建H2O2诱导HSCs自噬模型;（2）IL-10能降低H2O2诱导的HSCs自噬水平;（3）IL-10通过上调Akt/mTOR/STAT3通路蛋白磷酸化减轻H2O2诱导的HSCs自噬水平。
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