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目的研究CamkⅡδ基因沉默对丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)、c AMP应答元件结合蛋白(CREB)以及活化T细胞核因子1(NFATc1)蛋白活性和破骨细胞分化的影响及分子机制。方法1 CamkⅡδ基因沉默对破骨细胞分化、功能的影响:将RAW264.7细胞分为3组:对照组、阴性载体组和干扰组。采用表达绿色荧光的阴性载体病毒转染细胞,确定最适的病毒转染MOI值以及转染效率。重组慢病毒转染12 h后加入50ng/ml的核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)诱导培养5 d,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、牛骨磨片吸收陷窝检测来评价破骨细胞生成及骨吸收情况;Real-time PCR和免疫印迹法检测CamkⅡδ的m RNA及蛋白表达水平;免疫荧光细胞化学、免疫印迹法检测NFATc1蛋白表达水平。2 CamkⅡδ基因沉默对CREB蛋白活化的影响:RAW264.7细胞分为阴性载体组和干扰组,转染3 d后加入50ng/ml RANKL诱导0 h、1h、3h、6h、12h、24h,免疫印迹法检测CREB蛋白磷酸化水平。3 CamkⅡδ基因沉默对MAPKs信号活化的调节机制:RAW264.7细胞分为阴性载体组和干扰组,转染3 d后加入50ng/ml RANKL诱导0 min、5min、10 min、15 min、30 min、60 min,免疫印迹法检测细胞外信号调节激酶(ERK)1/2、氨基末端激酶(JNK)、丝裂原激活蛋白激酶(p38)蛋白磷酸化水平;4 MAPKs信号阻断对破骨细胞分化及相关因子NFATc1表达的影响:RAW264.7细胞分为4组:对照组、ERK1/2抑制剂(PD98059)组、JNK抑制剂(SP600125)组、P38抑制剂(SB203580)组,每组用RANKL诱导破骨细胞分化的同时,应用相应因子的抑制剂处理,3d后免疫印迹法检测NFATc1的蛋白表达水平,5d后TRAP染色评价破骨细胞生成。结果1阴性载体病毒转染细胞,结果显示最适病毒转染滴度MOI值为30,转染效率为74.9%。RANKL诱导5d后,三组细胞均出现TRAP+多核破骨细胞(胞核≥3个)和骨吸收陷窝,但干扰组破骨细胞数目、牛骨磨片骨吸收陷窝的数目和面积分别为10.8±2.1、8.5±1.1和5463±884.5μm2,显著低于阴性载体组的24.7±2.2、24.8±1.9、10491±635.3μm2和对照组的27.6±3.9、25.8±2.3、11447±710.4μm2(P<0.05);而对照组、阴性载体组之间无显著性差异(P>0.05)。Real-time PCR结果显示,与对照组相比,干扰组中CamkⅡδ的m RNA表达量显著降低,干扰效率为77.2%(P<0.05),而对照组和阴性载体组之间无显著差异(P>0.05)。免疫印迹结果显示,与阴性载体组(1.11±0.12)相比CamkⅡδ蛋白表达水平在干扰组(0.33±0.04)中显著下调,差异均具有统计学意义(P<0.01)。与对照组、阴性载体组相比,干扰组NFATc1的荧光强度明显减弱;免疫印迹法显示,干扰组NFATc1蛋白水平为1.52±0.04,较阴性载体组的2.25±0.12显著下调约72.3%(P<0.01),而对照组与阴性载体组无显著差异(P>0.05)。2 RANKL诱导0 h、1h、3h、6h、12h、24h,免疫印迹结果显示,干扰组中CREB磷酸化水平较阴性载体组下调了21%~56%,差异具有统计学意义(P<0.05)。3 RANKL诱导0min、5 min、10 min、15 min、30 min、60 min,免疫印迹结果显示CamkⅡδRNA干扰组各时间点p-ERK1/2、p-JNK和p-p38活化均显著下调;与阴性载体组比较,p-ERK1/2、p-JNK、p-p38分别下调了55%~64%(P<0.05)、12%~40%(P<0.01)和25%~52%(P<0.01),差异均具有统计学意义。4与对照组比较,ERK1/2抑制剂PD98059、JNK抑制剂SP600125和P38抑制剂SB203580均能够显著抑制RANKL诱发的NFATc1蛋白表达上调;三种抑制剂分别使NFATc1蛋白表达水平下调了37.3%(P<0.01)、42.1%(P<0.05)和38.2%(P<0.05),差异具有统计学意义。ERK1/2抑制剂组、JNK抑制剂组和P38抑制剂组中TRAP+多核破骨细胞数目分别为9.7±1.5、10.0±2.0、8.7±2.1,较对照组中的16.0±1.0分别下降了39.4%、37.5%和45.6%,结果具有显著性差异(P<0.01)。结论CamkⅡδ基因沉默可显著抑制破骨细胞的分化和生成,CREB和MAPKs信号分子ERK1/2、JNK、P38参与CamkⅡδ对破骨细胞分化和骨吸收功能的调控作用。