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目的探讨含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(src-homology domain 2-containing protein tyrosine phosphatase 2,SHP2)对体外活化肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)凋亡的影响。方法通过反复感染AD293细胞,扩增携带野生型SHP2(PTPN11)基因并表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的重组腺病毒Ad-SHP2、携带靶向SHP2的RNA干扰序列[短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)]并表达GFP的重组腺病毒Ad-shRNA/SHP2及仅表达GFP的对照空病毒Ad-GFP;体外培养人肝星状细胞系LX-2,将重组腺病毒Ad-SHP2、Ad-shRNA/SHP2及对照空病毒Ad-GFP分别转染LX-2细胞;应用实时荧光定量PCR技术检测活化HSC的SHP2 mRNA表达;应用Western blot技术检测活化HSC的SHP2、Bax、Bcl-2蛋白表达;采用末段脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末段标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)、膜联蛋白-V(Annexin-V)及碘化丙啶(propidium iodide,PI)双标记流式细胞术检测活化HSC的凋亡。应用SPSS22.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,两组间均数比较采用LSD检验,以P<0.05为差异有统计学意义。实验分组:(1)Control组:腺病毒转染时,以DMEM代替病毒液;(2)Ad-GFP组:转染仅表达GFP的空病毒Ad-GFP;(3)Ad-shRNA/SHP2组:转染携带靶向SHP2的shRNA并表达GFP的重组腺病毒Ad-shRNA/SHP2;(4)Ad-SHP2组:转染携带野生型SHP2(PTPN11)基因并表达GFP的重组腺病毒Ad-SHP2。结果1通过反复感染AD293细胞获得实验所需滴度的腺病毒,三种腺病毒Ad-GFP、Ad-shRNA/SHP2及Ad-SHP2的滴度分别为:1.6×10~8 pfu/ml、1.4×10~8pfu/ml及1.2×10~8 pfu/ml。2腺病毒Ad-GFP和Ad-shRNA/SHP2以感染倍数100、Ad-SHP2以感染倍数300转染LX-2细胞,48小时后通过倒置荧光显微镜计算其转染效率均大于80%。3腺病毒感染肝星状细胞48小时,实时荧光定量PCR检测各组HSC的SHP2 mRNA表达,以Control组HSC的SHP2 mRNA表达量为1,则Ad-GFP组、Ad-shRNA/SHP2组、Ad-SHP2组HSC的SHP2 mRNA表达量相对于Control组的倍数分别为1.109倍、0.256倍、7.554倍。Ad-SHP2组HSC的SHP2 mRNA表达量明显高于Control组、Ad-GFP组及Ad-shRNA/SHP2组(P<0.05);而Ad-shRNA/SHP2组HSC的SHP2 mRNA表达量则明显低于Control组、Ad-GFP组及Ad-SHP2组(P<0.05);但Ad-GFP组与Control组HSC的SHP2mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。进一步应用Western blot分析各组HSC的SHP2蛋白表达,Ad-SHP2组HSC的SHP2蛋白表达(1.852±0.138)明显高于Ad-shRNA/SHP2组(0.759±0.120)、Control组(1.271±0.206)及Ad-GFP组(1.336±0.197),P<0.05;而Ad-shRNA/SHP2组HSC的SHP2蛋白表达明显低于Ad-SHP2组、Control组及Ad-GFP组(P<0.05),但Ad-GFP组与Control组HSC的SHP2蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。4 TUNEL法检测各组HSC凋亡显示:Ad-shRNA/SHP2组HSC凋亡率(12.755±1.606)%明显高于Ad-SHP2组(1.520±0.259)%、Control组(3.077±0.731)%及Ad-GFP组(3.250±0.851)%,P<0.05;Ad-SHP2组HSC凋亡率明显低于Control组、Ad-GFP组、Ad-shRNA/SHP2组(P<0.05);而Ad-GFP组与Control组HSC凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。5 Annexin-V/PI双标记流式细胞术检测各组HSC凋亡显示:Ad-shRNA/SHP2组HSC凋亡率(19.340±2.505)%明显高于Ad-SHP2组(2.442±0.931)%、Control组(9.438±0.804)%及Ad-GFP组(8.893±1.982)%,P<0.05;Ad-SHP2组HSC凋亡率明显低于Control组、Ad-GFP组及Ad-shRNA/SHP2组(P<0.05);而Ad-GFP组与Control组HSC凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。6腺病毒感染HSC 48小时,应用Western blot技术分析各组HSC的Bax蛋白表达,Ad-shRNA/SHP2组HSC的Bax蛋白表达(2.493±0.203)显著高于Ad-SHP2组(1.545±0.208)、Control组(1.989±0.147)及Ad-GFP组(1.999±0.162),P<0.05;Ad-SHP2组HSC的Bax蛋白表达明显低于Control组、Ad-GFP组、Ad-shRNA/SHP2组(P<0.05),但Ad-GFP组与Control组HSC的Bax蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。7腺病毒感染HSC 48小时,应用Western blot技术分析各组HSC的Bcl-2蛋白表达,Ad-shRNA/SHP2组HSC的Bcl-2蛋白表达(1.042±0.148)明显低于Ad-SHP2组(2.134±0.247)、Control组(1.707±0.146)及Ad-GFP组(1.521±0.142),P<0.05;而Ad-SHP2组HSC的Bcl-2蛋白表达明显高于Control组、Ad-GFP组及Ad-shRNA/SHP2组(P<0.05),但Ad-GFP组与Control组HSC的Bcl-2蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论1 SHP2表达变化对体外活化肝星状细胞的凋亡有明显影响,其表达变化与活化肝星状细胞的凋亡呈负相关,即SHP2表达下调可诱导活化肝星状细胞凋亡,而SHP2表达上调则可抑制活化肝星状细胞凋亡。2 Bcl-2/Bax机制参与了SHP2对体外活化肝星状细胞凋亡的调控,即SHP2表达下调使活化肝星状细胞的Bax表达增加、Bcl-2表达下降,而SHP2表达上调则使活化肝星状细胞的Bax表达下降、Bcl-2表达增加。图6幅;表6个;参75篇。