抗生素是20世纪最重要的医学发现之一,它有效地治疗及控制了细菌感染性疾病。近年来由于抗生素在临床上以及动物养殖业上的广泛应用,导致了抗生素耐药基因和耐药菌在全球范围内广泛传播,这些耐药基因通过水平转移的方式能够在人体、环境和养殖动物之间进行迁移,这一问题已经成为全球性的公共卫生和食品安全问题。目前抗生素耐药基因的挖掘主要集中在临床菌,但研究表明,临床菌的耐药基因起源于土壤中的细菌,土壤中包含了大量未被发现的耐药基因,因此从土壤中发现抗生素耐药基因具有重要的意义。土壤中微生物的数量巨大、种类繁多,但在现有的实验室条件下,有超过99%的微生物通过传统的培养方法无法被研究,而宏基因组学技术的出现解决了这一难题,它的研究对象是特定环境中所有微生物的DNA总和,不仅可以研究可培养微生物的耐药基因,而且还能研究不可培养微生物的耐药基因,成为筛选土壤微生物中的抗生素耐药基因的有力手段。四环素类抗生素是一类广谱抗生素,因价格低廉、副作用小而在临床上应用最为广泛,在过去几十年的使用中,四环素耐药现象越来越广泛,四环素耐药基因在临床上及动物性食品中分布较为广泛,目前为止,在临床上已经监测出几十种耐药基因,本课题运用功能宏基因组学的方法筛选土壤宏基因组文库,挖掘土壤微生物来源的新型四环素耐药基因。寻找四环素耐药基因不仅对临床上耐药基因的爆发具有早期预警作用,而且对研究新型抗生素具有重要的借鉴意义。本课题通过功能宏基因组学筛选的方法对已经构建的西藏文库、云南文库和四川文库三个土壤宏基因组文库进行四环素耐药菌株的筛选,克隆测序结果经生物信息学手段分析发现,阳性克隆上的外排泵耐药基因与临床上发现的外排泵基因的最大相似度为80%-90%,而发现的四环素钝化酶基因与临床上唯一确定的四环素破坏酶基因tet(X)的相似度仅为20%和21%,为新型的四环素钝化酶基因,对四环素钝化酶耐药基因进行体外生化反应确证钝化酶的功能。具体结果:1.通过对三个土壤文库进行筛选,得到24耐药阳性亚克隆,测序结果经BLASTx比对及分析,得到21个MFS(major facilitator superfamily)外排泵基因、1个MATE(multidrug and toxic compound extrusion)转运基因以及2个四环素钝化酶基因(tetracycline inactivation),说明四环素耐药基因广泛分布于不用地区、不同类型的土壤中。21个MFS外排泵基因之间的氨基酸序列相似度为40%-60%,与已知的MFS外排泵基因的相似度为80%-90%,其中YN1469与Burkholderia sp.BT03菌株来源的四环素耐药基因的序列相似度达到98%;另外,来自云南文库的YN1469和YN2306分别与来自四川文库的SC2451和SC6的氨基酸序列相同,说明耐药基因可能通过水平基因转移方式进行传播;1个MATE转运基因与Acidobacteria bacterium OLB17菌株来源的外排蛋白序列的相似度仅为59%,且仅对四环素具有耐药性,对其他类抗生素敏感,为新型的MATE转运蛋白基因;2个四环素钝化酶基因氨基酸序列之间的相似度为73%,且两者的MIC值相同,均为64 μg/mL,与临床上唯一确定的四环素钝化酶基因tet(X)的氨基酸序列的相似度分别为20%和21%,为新型的四环素钝化酶基因。2.对获得的2个四环素钝化酶进行体外活性的确证。钝化酶与底物四环素进行体外反应,经HPLC检测及分析,发现底物四环素降解及产物生成,证实了钝化酶的体外破坏作用:MQ776与四环素的反应随着时间的延长,底物减少量不明显,但有产物生成,且产物能稳定存在,MQ1435与四环素的反应随着时间的延长,底物减少量明显,且有产物生成,但产物在该反应条件下不能稳定存在;对反应产物进行LC-MS检测及分析,发现MQ776和MQ1435催化反应的产物峰保留时间有所不同,反应产物的质荷比(m/z)均为461.20。确定最适反应pH值,经检测及分析,发现MQ776与底物体外反应的产物在偏碱和偏酸性条件下均能稳定存在,但产物的量没有积累;MQ1435与底物体外反应的产物在偏碱性条件下不能稳定存在,但在偏酸性条件下能稳定存在,但产物的量没有增加,说明MQ776和MQ1435钝化酶的催化活性是不同的。本课题通过功能宏基因组学的方法筛选土壤微生物中的四环素耐药基因,有助于四环素耐药机制的深入研究,对控制四环素耐药基因的传播有着重要的意义。