胃癌在我国是常见的消化系统恶性肿瘤之一,占恶性肿瘤致死率第二位。虽然胃癌早期发现可以治愈,但是大部分病人确诊时已属晚期并且预后较差,临床仍然急需探索新的诊断及预后指标及治疗靶点。人类基因组中除了2%的蛋白编码基因外,大部分是由非编码蛋白的基因组成。转录产生的长链非编码RNA能够影响细胞的生物学行为。大量文献报道,长链非编码RNA在各种肿瘤中发挥重要作用。长链非编码RNA TINCR可以调控人表皮组织分化,并且在人鳞状细胞癌组织中表达下调。有文献证实TINCR可以绑定staufen1(STAU1)蛋白介导分化相关mRNA的稳定性,但目前国内外尚无关于TINCR在胃癌中功能的研究。本课题将从胃癌细胞株,临床组织标本及活体动物三个层面上研究TINCR对胃癌细胞增殖和凋亡的影响,并初步探讨其作用机制,为进一步临床转化提供理论依据。本研究具体内容包含以下六部分:第一部分:TINCR在胃癌组织及细胞系中的表达及临床意义目的:检测TINCR在胃癌组织及细胞系中的表达水平,探索其表达水平在胃癌诊断及预后中临床意义。方法:分别提取80对胃癌及癌旁组织标本和胃癌细胞系中的RNA,逆转录成cDNA,利用实时定量RT-PCR(qRT-PCR)的方法,检测TINCR的表达水平。用SPSS20.0软件包对80例胃癌病人的临床病理资料及TINCR表达水平进行统计学分析。结果:1、TINCR的表达在胃癌组织中明显高于癌旁组织(P<0.01)。2、TINCR的表达在正常胃粘膜细胞系GES1中明显低于胃癌细胞系SGC7901(P<0.01),BGC823(P<0.01),MGC803(P=0.015),和MKN45(P=0.031)。3、以癌旁正常胃粘膜组织作为对照,做受试者工作(roc,receiveroperatingcharacteristic)曲线,区分癌和癌旁的截尾值为9.05(Δct值),曲线下面积为0.701;95%可信区间(ci,confidenceinterval)=0.619-0.782,p<0.001;敏感性和特异性分别为:0.65和0.71。4、将80例病人癌组织中tincr的表达水平依据相对于癌旁正常胃粘膜是否上调及下调,分为高表达组和低表达组,结果表明:高tincr表达组病人(n=55)与低表达组病人(n=25)相比,有较深的侵袭深度(p=0.005)及较晚的肿瘤分期(p=0.002),有较高的复发率(高tincr表达组中位无病生存期为21个月,三年无病生存率为31.6%;而低tincr表达组中位无病生存期为29.7个月,三年无病生存率为57.6%。p=0.035)。单因素分析提示:tnm分期(p<0.001),淋巴结转移(p=0.003),tincr的表达水平(风险指数=2.242;95%可信区间:1.010-4.976;p=0.047)可作为独立预后的指标。进一步的多因素分析提示tnm分期跟预后明显相关。结论:tincr在胃癌组织及细胞中表达上调,且有可能作为胃癌诊断及预后的生物学指标。第二部分:tincr上游调控因子的检测目的:探索tincr在胃癌组织及细胞系中异常表达的机制。方法:利用生物信息学方法分析tincr启动子区有可能结合的转录因子,应用染色质免疫共沉淀(chip)、荧光素酶报告基因、细胞转染及qrt-pcr方法验证sp1(specialprotein1)是否可以调控tincr的表达并鉴定其与tincr启动子区可能结合的位点。结果:1、生物信息学分析发现tincr启动子区有三个sp1的结合位点,分别位于转录起始点前163—153碱基(e1),88—78碱基(e2),和16—6碱基(e3)。2、chip实验提示:sp1结合部位在tincr启动子区的e1区附近。3、荧光素酶报告基因实验提示:过表达sp1可以激活载有tincr启动子区-201—+163碱基序列的荧光素酶报告质粒。4、为了进一步证实sp1绑定的区域,我们删失e1区域,重复上述实验,结果提示:删失e1序列后明显影响了过表达sp1对载有tincr启动子区-201—+163(Δe1)碱基序列的荧光素酶报告质粒的激活。5、在胃癌细胞株中转染小干扰rna来敲低内源性sp1的表达,结果发现:敲低sp1的表达后,tincr表达水平明显下调。结论:胃癌组织及细胞中tincr表达水平的上调可能受sp1的调控。第三部分:tincr在胃癌中的功能鉴定目的:探讨tincr对体外培养的胃癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响及体内移植瘤的作用。方法:构建tincr的小干扰序列(sirna)及tincr的过表达质粒(pcdna3.1-tincr),分别以乱序(scrambled)及空质粒(pcdna3.1)作为对照组,胃癌细胞株中转染上述干扰序列及过表达载体,mtt及克隆形成实验检测敲低及过表达tincr后对细胞增殖的影响,流式细胞仪检测对胃癌细胞周期分布的影响,annexinv-pi双染法检测对胃癌细胞凋亡的影响。westernblot检测bcl-2、bax及caspase3等凋亡相关蛋白的表达。选用体重(16土2)克balb/c,nu/nu裸鼠8只,在其腋窝皮下接种sgc7901细胞,建立胃癌移植瘤模型。构建敲低tincr的重组腺病毒质粒(shrna-tincr)及携带乱序序列的重组腺病毒质粒(scrambled),sgc7901细胞分别稳定转染上述腺病毒质粒,分别接种裸鼠的两侧腋窝。每3天测量瘤体大小,接种21天后处死小鼠,剥除肿瘤称重。结果:1、mtt实验表明:胃癌细胞株中,转染了sirna后,与乱序组比较,明显抑制了胃癌细胞的增殖。同时,过表达tincr后,与转染空载体组比,增加了细胞的生长率。2、克隆形成实验表明:胃癌细胞株中,稳定转染了shrna后,与乱序组比较,明显抑制了胃癌细胞的增殖。同时,过表达tincr后,与转染空载体组比,增加了细胞的增殖。3、细胞周期结果提示:敲低了tincr后,胃癌细胞的细胞周期阻滞在g0-g1期,进入s期的细胞减少。相反,过表达tincr明显促进细胞周期的进展。4、流式细胞仪检测凋亡提示:敲低了tincr后,细胞凋亡明显增加。5、蛋白印迹实验提示:敲低了tincr后,抑制凋亡的相关蛋白bcl-2下调,裂解型凋亡蛋白caspase3活化。6、裸鼠体内成瘤实验提示:稳定转染了重组腺病毒质粒(shrna-tincr)与转染空载体相比,明显抑制移植瘤的生长,并且ki-67的表达明显降低。结论:tincr能够促进胃癌细胞的增殖。第四部分:tincr下游靶基因的检测目的:检测tincr发挥功能所依赖的通路及下游靶基因。方法:在sgc7901细胞中分别转染tincr的小干扰序列及乱序,提取细胞的rna,利用rna转录组新一代测序技术检测敲低tincr后引起的转录组的变化。对变化的基因进行生物信息学分析,包括聚类分析,基因本体(go,geneontology)分析,基于kegg(thekyotoencyclopediaofgenesandgenomes)数据库的通路分析等。用qrt-pcr方法对差异表达的基因进一步验证。westernblot检测cdkn1a/p21、cdkn2b/p15及klf2等增殖及凋亡相关蛋白的表达。免疫组织化学检测移植瘤中cdkn1a/p21、cdkn2b/p15及klf2等增殖及凋亡相关蛋白的表达。结果:1、rna转录组测序结果提示:敲低tincr表达后,有326个mrna上调1.5倍,304个mrna下调1.5倍。2、go分析及kegg通路分析提示:敲低tincr表达后,下游变化的基因参与了细胞周期进程及细胞凋亡过程。3、qrt-pcr进一步证实转录组测序的结果,敲低tincr表达后,许多周期及凋亡相关的mrna表达发生改变,其中klf2、cdkn1a/p21和cdkn2b/p15明显上调。4、胃癌细胞株中,外源性过表达或内源性敲低tincr能够下调或上调klf2、cdkn1a/p21和cdkn2b/p15基因mrna及其蛋白的表达。5、免疫组织化学实验提示:敲低tincr后,移植瘤中klf2、cdkn1a/p21及cdkn2b/p15表达上调。结论:tincr下游靶基因参与细胞周期进程和细胞凋亡的调控,其中klf2、cdkn1a/p21及cdkn2b/p15可能参与了tincr的细胞周期及细胞凋亡调控功能。第五部分:tincr影响胃癌细胞增殖和凋亡的机制探讨方法:应用细胞核细胞质分离提取rna法鉴定tincr在胃癌细胞中的亚细胞定位,qrt-pcr检测胃癌细胞中分别敲低stau1及ufp1后klf2的mrna表达水平的变化。rna免疫共沉淀(rip)、rnapulldown实验证实stau1蛋白是否结合tincr和klf2mrna。分别构建含有flag标签的stau1过表达质粒(pcdna3.1-stau1-flag),含有klf23’-utr的荧光素酶质粒(pluc-klf23’-utr),含有arf1stau1绑定序列(sbs)的荧光素酶质粒(pluc-arf1sbs)(阳性参照),phcmv-mup质粒(阴性参照),sgc7901细胞共转染上述质粒,免疫共沉淀实验(ip)证实stau1是否结合klf2的3’-utr序列。胃癌细胞中敲低及过表达tincr后,检测klf2mrna的半衰期。结果:1、tincr主要在胃癌细胞的胞浆中表达。2、分别敲低stau1及upf1后,klf2的mrna表达均升高。3、rip实验证实:stau1可以和tincr及klf2的mrna结合。4、rnapulldown实验证实:tincr可以和stau1及upf1蛋白结合,tincr可以和klf2mrna结合。5、敲低tincr的表达可以降低stau1和klf2mrna的相互作用,敲低stau1的表达可以降低tincr与klf2mrna的相互作用。6、抗flag的抗体可以免疫沉淀出rluc-klf23’-utr和rluc-arf1sbs,但不能沉淀出mupmrna。7、敲低tincr的表达后,klf2mrna的半衰期延长,而过表达tincr后klf2mrna的半衰期降低。结论:tincr可以募集stau1到klf2mrna的3’utr区,通过依赖upf1的mrna降解机制介导klf2mrna的降解,从而影响klf2mrna及蛋白的表达。第六部分:tincr下游靶基因klf2在胃癌中的功能鉴定及机制探索方法:构建敲低内源性klf2表达的小干扰序列(sirna)以及klf2的过表达质粒(pcmv-tag2b-klf2-flag,drtaniguchi赠送),分别以乱序(scrambled)及空质粒(pcmv-tag2b)作为对照组,胃癌细胞株中转染上述干扰序列及过表达载体,mtt及克隆形成实验检测敲低及过表达klf2后对细胞增殖的影响,annexinv-pi双染法检测对胃癌细胞凋亡的影响。westernblot检测cdkn1a/p21及cdkn2b/p15蛋白的表达。选用体重(16土2)克balb/c,nu/nu裸鼠6只,在其腋窝皮下接种sgc7901细胞,建立胃癌移植瘤模型。sgc7901细胞分别稳定转染klf2过表达质粒及空质粒,分别接种裸鼠的两侧腋窝。每2天测量瘤体大小,接种16天后处死小鼠,剥除肿瘤称重。染色质免疫共沉淀(chip)实验鉴定klf2是否和cdkn1a/p21及cdkn2b/p15的启动子区结合而影响其转录。qrt-pcr检测80对胃癌及癌旁组织标本和胃癌细胞系中klf2的表达,免疫组织化学检测40对胃癌及癌旁组织中klf2蛋白的表达。统计学分析组织标本中klf2mrna与tincr之间的关系,分析klf2在胃癌病人预后中的意义。“拯救实验”验证klf2是否参与了tincr调控胃癌细胞增殖和凋亡的作用。结果:1、mtt及克隆形成实验提示:干扰klf2的表达可以促进胃癌细胞的增殖,而过表达klf2后抑制胃癌细胞的增殖。2、annexinv-pi双染法检测提示:过表达klf2后可以促进胃癌细胞的凋亡。3、裸鼠移植瘤实验表明:过表达klf2后抑制裸鼠体内移植瘤的生长。4、过表达或敲低klf2后,cdkn1a/p21及cdkn2b/p15表达水平升高或者降低。5、KLF2可以结合CDKN1A/P21及CDKN2B/P15的启动子区调控其转录。6、胃癌组织及细胞中KLF2的表达水平较癌旁正常组织及胃粘膜正常上皮细胞系降低,并且KLF2的低表达提示预后不良;在临床组织标本中,KLF2的表达与TINCR的表达成负相关。7、共转染siKLF2及siTINCR后,可以补救沉默TINCR引起的增殖抑制及促进凋亡效应;并能够补救TINCR敲低后引起的CDKN2B/P15及CDKN1A/P21的表达升高。结论:KLF2通过调控CDKN1A/P21及CDKN2B/P15的转录及表达而抑制胃癌细胞的增殖、促进其凋亡;KLF2参与了TINCR调控胃癌细胞增殖和凋亡的作用。全文结论:长非编码RNA TINCR在胃癌组织及多个细胞株中高表达,其表达水平可以明显的区分癌组织及癌旁组织,TINCR高表达的胃癌病人预后较差。TINCR在胃癌组织中高表达至少部分通过核转录因子SP1的调控,且TINCR可以促进胃癌细胞的增殖。KLF2是TINCR重要的下游靶基因,其可以通过调控CDKN1A/P21及CDKN2B/P15的转录及表达而抑制胃癌的增殖。机制探索发现:TINCR可以通过绑定STAU1蛋白而引起KLF2 mRNA的降解。因此我们得到以下结论:核转录因子SP1诱导TINCR的过表达,TINCR募集STAU1蛋白到KLF2的3’UTR区,通过UPF1依赖的mRNA降解机制促进KLF2 mRNA的降解,KLF2表达减少进一步降低CDKN1A/P21及CDKN2B/P15的转录及表达,进而促进细胞周期进程而引起致瘤作用。