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目的:观察不同浓度ICS Ⅱ对rBMSCs成骨分化和成骨活性的影响,筛选出ICS Ⅱ促进rBMSCs成骨分化最佳浓度级别,并初步探讨其分子学机制,为ICS Ⅱ结合组织工程学治疗ONFH提供理论基础。方法:1.选取6只SPF级SD大鼠幼鼠,脱颈处死,全骨髓贴壁法分离、提取rBMSCs,光镜下观察细胞形态和生长状态。取原代细胞,应用成骨诱导分化培养基、成软骨诱导分化培养基、成脂诱导分化培养基进行诱导,鉴定rBMSCs的多向分化能力。2.rBMSCs传代培养至第三代,将细胞接种于12孔或96孔细胞培养板。设立低、中、高剂量三个实验组,分别选用ICS Ⅱ浓度为1μg/mL、10μg/mL和100μg/mL的培养基进行培养,对照组为含有与实验组相同浓度的DMSO溶液。待细胞融合度达60%-70%时加入成骨诱导液进行成骨性诱导,2周后茜素红染色观察比较各组钙化结节形成量;成骨性诱导的第3、6、9、12天四个时间点进行ALP活性检测,测定细胞成骨活性;在诱导0h、4h、12h、24h、48h、96h检测成骨相关基因Osterix(OSX)、Runx-2表达量。根据染色及检测结果分析在rBMSCs成骨分化过程中ICS Ⅱ发挥作用的最佳浓度级别,并初步探讨其分子学机制。结果:1.本实验所提取分离的rBMSCs在培养的各个阶段与骨细胞图谱中所描述的形态学特征均吻合。在多向分化诱导方面,细胞形态逐渐改变,符合成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞的形态特征,染色结果显示不同分化方向的细胞分别出现钙盐沉积、蛋白聚糖、油滴等的生理学特性,证明该细胞具有较强的多向分化能力。2.不同浓度ICS Ⅱ对rBMSCs成骨分化的影响:(1)茜素红染色结果:实验组的钙化结节数量均明显高于对照组;实验组组间比较显示:中剂量组钙化结节数量明显高于低剂量组和高剂量组,低剂量组和高剂量组钙化结节数量未见明显不同。(2)ALP检测结果显示:在第3、6、9、12天,实验组ALP活性均高于对照组,且差异具有统计学意义(P<0.05);中剂量组ALP活性均高于低剂量组和高剂量组,差异具有统计学意义(P<0.05);低剂量组与高剂量组之间相比,差异无统计学意义(P>0.05)。(3)成骨相关基因OSX表达检测:在不同时间点检测中,低、中、高三个实验组的基因表达均高于对照组,且差异具有统计学意义(P<0.05);中剂量组在不同时间点基因表达高于低剂量组和高剂量组,差异具有统计学意义(P<0.05);低剂量组与高剂量组比较,在第12h时检测结果差异有统计学意义(P=0.044),其余时间点差异无统计学意义(P>0.05)。(4)Runx-2表达量检测:在不同时间点检测中,低、中、高三个实验组的基因表达均高于对照组,且差异具有统计学意义(P<0.05);中剂量组在不同时间点表达均高于和低剂量组、高剂量组,差异具有统计学意义(P<0.05);低剂量组和高剂量组比较,在第48 h时差异有统计学意义(P=0.045),其余时间点差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.ICS Ⅱ可以显著促进rBMSCs成骨分化,且促进作用与浓度有一定关系。2.通过细胞染色、ALP活性测定,初步确定10μg/mL的浓度的ICS Ⅱ可获得良好的成骨分化和成骨活性效果。3.成骨相关基因OSX、Runx-2的表达与细胞染色、ALP检测趋向一致,证实前面所述结果,并且提示ICS Ⅱ是通过增强OSX,Runx-2的表达发挥其促进rBMSCs成骨性分化作用。4.ICS Ⅱ可通过组织工程技术直接用于ONFH的靶点治疗,并且有望将浓度确定至精确值,最大化发挥其促进成骨分化和成骨活性作用。