癫痫是中枢神经系统常见疾病之一,根据WHO提供的数据,我国现有癫痫患者900万,其中2/3为儿童。癫痫的病因复杂,其中遗传因素占有重要地位,40%以上的癫痫患者具有遗传因素,尤其是在儿童患者中。在国际抗癫痫联盟（ILAE）2010年癫痫及癫痫综合征分类诊断标准中,提出将遗传性癫痫作为一个新的分类。癫痫是大脑神经元高度异常同步化放电引起的,而离子通道是担负神经元动作电位传导以及形成神经环路的核心构件,任何编码离子通道的基因异常都有可能引起通道的结构和（或）功能改变,造成中枢神经系统电平衡失衡,神经元异常同步化放电。因此,将编码离子通道的基因作为癫痫致病基因的候选基因。在动物模型的研究如tottering鼠模型发现,编码离子通道的基因突变或缺失能诱发小鼠癫痫发作。而且已在一些癫痫综合征的研究中证实,如全面性癫痫伴热性惊厥附加症（generalized epilepsy with febrile seizures plus, GEFS+）证实与钠离子及氯离子通道异常有关,良性家族性新生儿惊厥（benign familial neonatal convulsions, BFNC）与钾离子通道异常有关。这些证据表明离子通道的改变是癫痫的发病机制之一。夜发性额叶癫痫（nocturnal frontal lobe epilepsy, NFLE）是一种特发性部分性癫痫。1994年,Scheffer等首次报导一个有多名NFLE患者的家系病例,在该家系中NFLE呈常染色体显性遗传,遂命名为常染色体显性遗传夜发性额叶癫痫（autosomal dominant nocturnal frontal epilepsy, ADNFLE）。NFLE则被认为是ADNFLE的散发形式。随后Steinlein在一个澳大利亚大家系中首次明确ADNFLE致病基因,使其成为第一个明确致病基因的单基因遗传特发性局灶性癫痫综合征。ADNFLE通常儿童期起病,症状持续至成人期,患病率不详,男女发病率相似。发病年龄从2个月到52岁,但主要发病在儿童晚期的7-12岁之间,平均11岁,90%患者在20岁前出现第一次发作。ADNFLE主要表现为丛集性、短暂性的频繁夜发性运动发作,多于入睡后不久或觉醒前发作,日间发作罕见,常被误诊为睡眠障碍等非痫性发作。神经系统体格检查、影像学检查和发作间期脑电图常无异常。部分发作期脑电图可见癫痫样放电明显位于额区,也可表现为前头部导联的发作性节律慢波活动。散发患者与家系患者临床特征和脑电图特征相似。本病一般依据临床特点诊断,尚无特异性诊断指标,所以在诊断以及鉴别诊断方面有较大的困难,易造成误诊、漏诊,影响患儿的生活质量,严重者甚至威胁患儿生命。目前研究已明确部分ADNFLE的发生与编码烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）亚基基因的突变有关,但不同种族存在一定的差异。Steinlein等首次在编码烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR） a4亚基基因CHRNA4发现一错义突变,证实ADNFLE与nAChR亚基突变有关,随后编码nAChRβ2亚单位基因CHRNB2及编码α2亚单位基因CHRNA2相继被明确为ADNFLE致病基因。由于散发病例与家系病例有相似的临床表现,据此推测散发病例或许与家系病例有着相同的遗传背景,但目前仅在两例散发病例报导发现nAChR基因突变,其余已知nAChR亚基基因突变均存在于家系患者中。近年国内首次报道在散发患者CHRNA4基因发现一错义突变R308H。但仅约10%的ADNFLE家系及个别散发患者在编码nAChR亚基基因发现明确的基因突变,且不同家系携带突变位点不同,推测ADNFLE具有遗传异质性,nAChR可能不是ADNFLE唯一致病基因。ADNFLE不仅具有遗传异质性,还具有表型多样性,其临床表型与基因表型关系尚未明确,不同家族间患者的临床表现复杂性和严重性差异很大,同一家族携带同一突变不同患者表型也不尽相同,而具有相似表型的不同家族患者携带不同基因突变。ADNFLE还具有不完全外显性,在大多数已知家系的遗传外显率多为70-80%或更低。尽管人们对ADNFLE进行了不懈的研究,也己取得了上述研究进展。但由于ADNFLE的表型多样性和遗传异质性,为寻找ADNFLE致病基因带来了较大的困难。传统的研究方法存在耗时长、人力物力损耗大、无法大规模高效富集基因片段、难于满足当前分子遗传学高通量测序发展要求等缺点。随着新一代测序技术的发展,运用全基因组外显子测序技术鉴定致病基因成为主要方法。全基因组外显子测序是利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。全外显子组测序具有可发现外显子区的绝大部分的疾病相关变异以及常见变异和频率<5%低频突变,只需对基因组约1%的序列测序,使得全基因外显子组测序成为一种鉴定孟德尔疾病致病基因的有效策略。Heron等应用全外显子组测序技术结合连锁定位分析在三个家系及一例NFLE患者中发现编码离子通道基因KCNT1三个新错义突变,推测KCNT1基因为ADNFLE新致病基因。以上均为nAChR可能不是ADNFLE唯一致病基因及查找ADNFLE新致病基因可行性提供了理论基础。前期我们共收集了中国人群ADNFLE患者257名,包括11个非亲缘家系（共42例家系患者）和215例散发病例。已对257例患者应用PCR产物直接测序的方法进行了CHRNA4、CHRNA2、CHRNB2的突变基因筛查,未发现已知的基因突变,提示CHRNA4、CHRNA2、CHRNB2可能不是中国人群ADNFLE的致病基因。现采用全基因组外显子测序方法,查找中国人群ADNFLE新致病基因,为ADNFLE的发病机制和遗传学研究提供新的研究方向。[对象和方法]1.对象：前期已收集确诊的中国人群（汉族）ADNFLE患者共257例,包括11个家系,共42例家系患者和215例散发病例,其诊断参照国际抗癫痫联盟2001年癫痫和癫痫综合征的分类诊断标准,对照组为健康人群500例。对所有患者详细询问、记录病史及家族史,建立相关资料库,完善视频长程脑电图、头部MRI检查；对所有病例及对照组抽取外周静脉血并抽提DNA。所有研究对象或其法定监护人均签署知情同意书,整个研究过程由广东省人民医院伦理委员会批准。2.全基因组外显子测序查找新致病基因前期已利用PCR产物Sanger测序技术对样本基因组DNA进行CHRNA4、 CHRNA2及CHRNB2等已经报道的致病基因的筛查,仅在一患者CHRNA4基因第五外显子上发现一新同义突变D190D（c.570C>T）,未发现已报导的热点突变。对于排查后未发现已知致病基因突变的样本中,从家系1中选择4个表型典型且一致的患者,应用外显子组捕获高通量测序,结合生物信息分析技术,找出具有中国人群背景的ADNFLE患者新致病基因。3.Sanger测序验证3.1对家系1中已做全外显子测序的四名患者共有的突变位点进行Sanger测序验证,测序结果应用Chromas2.22软件进行分析,并与基因的标准序列进行比对,以排除假阳性位点,阳性位点进行下一步验证。3.2突变位点家系内验证：对家系1中的7名患者（包括已做外显子测序的4名患者）和8名未发病成员验证步骤3.1得到的阳性位点。因ADNFLE具有不完全外显性,排除标准为发病者未携带的突变；同时在500名健康对照中验证以排除SNP。3.3突变位点家系外验证：ADNFLE具有遗传异质性,对其余10个家系及215例散发病人的突变基因（验证步骤3.2验证到的位点）全部外显子进行直接测序。若发现突变,则在NCBI SNP数据库查找是否已报导SNP及在500例健康对照中验证。3.4散发病例验证：首先挑选8名散发患者共有的位点验证,排除假阳性；然后根据第一步验证出来的突变基因在其他散发患者中验证。若无阳性位点,则挑选已报导的与癫痫相关的基因突变位点验证。[结果]1.通过全基因组外显子测序,获得12个ADNFLE患者（4个家系患者和8个散发患者）全基因组外显子测序样本的SNPs.indels的数据集合。2.采用Sanger测序对家系1中的7名患者（包括已做外显子测序的4名患者）和8名未发病成员验证发现7名患者及1名未发病成员均携有CaBP4基因新杂合错义突变（c.464G>T,p.G155D）,其余6名未发病成员均无；通过与NCBI数据库比对上述突变位于灵长类哺乳动物caBP4基因序列高度保守区；用SIFT预测分数为0.00,说明突变对蛋白结构有较大影响；二级结构分析突变点紧邻CaBP4蛋白结合离子结构域；突变位点在500名健康对照中为阴性。3.在其余10个家系及215例散发病例中对CaBP4基因全部外显子直接测序筛查未发现突变。4.对215例散发ADNFLE患者CHRNA7基因全部外显子筛查,未发现突变,在第5、6、7外显子发现3个cSNP（c.370G>A、c.698A>G和c.497₄98delTG）及2个SNP（c.654C>T、c.690G>A）。[结论]1、首次在一四代发病共7名患者的ADNFLE家系发现编码钙连接蛋白4基因（CaBP4）新杂合错义突变（p.G155D）,推测CaBP4基因可能为常染色体显性遗传夜发性额叶癫痫新致病基因。2、首次在中国ADNFLE家系中发现CaBP4基因突变,该突变在国内外未见报导。3.CHRNA7基因可能不是中国人群ADNFLE患者主要致病基因。