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目的:癌症是影响人类健康的一种顽疾,目前人类仍无法全面认识并攻克这一顽疾,是威胁人类健康的主要疾病,且癌症的发生发展与慢性炎症和氧化应激息息相关。NF-E2相关因子1（nuclear factor erythroid 2-related factor 1,Nfe2l1）是调节细胞抗氧化反应的核心转录因子,可针对外来化学物诱导的致癌性损伤提供必要的保护,在维持机体氧化还原稳态中发挥重要作用。巨噬细胞作为机体细胞免疫系统的重要一员,是固有免疫应答和适应性免疫应答的重要组成,在细胞吞噬、抗原提呈、组织修复等多方面发挥不可或缺的作用。肿瘤相关巨噬细胞（Tumor Associated Macrophage,TAM）代表了肿瘤中最丰富的先天免疫细胞,是一类大量浸润于多种器官组织中的单核巨噬细胞。TAM是影响癌症进展、转移和肿瘤复发的关键因素。TAM受肿瘤微环境中活性因子的刺激,可以分泌大量的细胞因子、生长因子及其它多种活性介质作用于肿瘤微环境,同时,具有功能异质性和可塑性,参与调控肿瘤的发生发展。因此本研究应用髓系细胞Nfe2l1特异性敲除小鼠以及小鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞为模型,研究Nfe2l1在肿瘤转移中的作用,探讨Nfe2l1调控TAM的可能机制,从而为临床肿瘤免疫治疗提供新靶点和实验依据。研究方法:1.Nfe2l1（M）-KO小鼠的构建及小鼠基因型鉴定:采用C57BL/6遗传背景的小鼠构建髓系细胞Nfe2l1特异性敲除小鼠,由Nfe2l1flox/flox和单核巨噬细胞Lyz2-Cre转基因鼠杂交获得,并已经常规繁育应用。利用鼠尾PCR法扩增DNA,琼脂糖凝胶成像系统获得小鼠DNA条带,鉴定基因型。2.原代巨噬细胞提取与纯度鉴定:将原代巨噬细胞以1×106的密度重悬于200μLPBS中,按照流式抗体说明书的比例加入相应抗体,室温孵育30 min后,检测小鼠表面特异性抗原CD11b与F4/80,应用流式细胞仪鉴定巨噬细胞纯度。3.Nfe2l1（M）-KO小鼠特异性敲除效果确认:通过实时定量聚合酶链式反应（Quantative polymaerase chain reaction,q PCR）检测骨髓诱导巨噬细胞（BMDM）中Nfe2l1的m RNA表达水平,以判断Nfe2l1（M）-KO小鼠巨噬细胞中Nfe2l1的敲除效果。4.小鼠皮下荷瘤模型和肺转移模型构建:应用Nfe2l1-KI和Nfe2l1（M）-KO小鼠皮下注射肺癌细胞,1×106/只,隔一天测量肿瘤大小,在实验终点收取肿瘤组织。应用Nfe2l1-KI和Nfe2l1（M）-KO小鼠尾静脉注射黑色素瘤细胞,1×105/只,两周后收取小鼠的肺组织。5.小鼠肺转移模型的评价与鉴定:收取小鼠时通过计数肺表面肿瘤个数,测量肺表面肿瘤直径,计算肺表面肿瘤体积及平均直径,并测量肺脏和脾脏重量等来评估肿瘤负荷;肺组织包埋切片,HE染色确认肺转移程度。6.划痕愈合实验:应用RAW 264.7（Scramble和Nfe2l1-KD）细胞,收集其培养上清液处理B16F10黑色素瘤细胞,观察黑色素瘤细胞6 h、24 h、48 h时划痕愈合的变化,计算划痕愈合率。7.肿瘤细胞上清液处理巨噬细胞:利用B16F10黑色素瘤细胞的上清模拟肿瘤微环境,分别作用于Nfe2l1（M）-KO与Nfe2l1-KI的BMDM,RT-q PCR检测Il10、Vegfα、Mmp9等基因的m RNA表达水平。结果:1.成功构建Nfe2l1（M）-KO小鼠模型:通过基因型检测分析确认Nfe2l1髓系细胞特异性敲除小鼠（Nfe2l1（M）-KO）模型建立成功。2.成功提取鉴定骨髓原代巨噬细胞。经流式细胞术检测巨噬细胞表面标志物,巨噬细胞纯度均>80%。Nfe2l1（M）-KO组较Nfe2l1-KI组小鼠骨髓原代巨噬细胞中Nfe2l1的表达量明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.成功构建皮下荷瘤模型:采用皮下注射肿瘤细胞进行皮下荷瘤造模,观察小鼠皮下肿瘤生长情况。数据显示,与对照组相比,Nfe2l1（M）-KO组小鼠的肿瘤重量和大小与Nfe2l1-KI组无明显差异,但是Nfe2l1（M）-KO组小鼠却更易发生自发转移,提示我们髓系细胞Nfe2l1特异性缺失之后可能对肿瘤的生长无影响,但促进肿瘤的转移,因此后续通过建立肿瘤转移模型检测髓系Nfe2l1缺失之后对肿瘤转移的影响。4.成功构建小鼠肺转移模型:本研究所用小鼠是以C57BL/6为遗传背景,采用尾静脉注射B16F10肿瘤细胞的方式进行造模,在到达实验终点时,收取小鼠肺组织。模型建立成功可以在小鼠肺表面观察到黑色瘤体,同时对小鼠肺组织进行切片染色可以发现,小鼠肺部出现腺瘤样增生,成功构建C57BL/6小鼠黑色素瘤肺转移模型。5.髓系细胞Nfe2l1缺失可以促进肿瘤转移:采用尾静脉注射B16F10肿瘤细胞构建肺转移模型,并且在整个造模期间对两组小鼠体重进行监测。数据表明,尾静脉注射肿瘤细胞对小鼠体重的影响并无明显差异。在实验终点时,根据大体照片所示,可明显观察到Nfe2l1（M）-KO组与Nfe2l1-KI组相比,小鼠肺转移情况更严重。后续对小鼠肺组织和脾组织进行称重,经胫骨长度校正,发现Nfe2l1（M）-KO组与Nfe2l1-KI组相比,两组间的脏器系数无明显差异。通过肿瘤负荷评估发现,Nfe2l1（M）-KO组肺表面肿瘤转移个数比Nfe2l1-KI组多,且差异具有统计学意义（P<0.05）。通过对小鼠肺表面肿瘤直径进行平均值计算发现,Nfe2l1（M）-KO组与Nfe2l1-KI组相比小鼠肺表面肿瘤平均直径并无明显差异。通过对肺表面肿瘤体积进行计算发现,Nfe2l1（M）-KO组与Nfe2l1-KI组相比肿瘤负荷总体积也无明显差异。6.骨髓巨噬细胞中M2型巨噬细胞所占比例升高:结果显示,Nfe2l1（M）-KO组与Nfe2l1-KI组小鼠脾组织中CD4+T cell和CD8+T cell所占比例无明显差异,骨髓巨噬细胞中M2型巨噬细胞所占比例有升高趋势,但差异无统计学意义。7.巨噬细胞Nfe2l1沉默可以促进肿瘤细胞的迁移:应用RAW 264.7 Scramble和RAW 264.7 Nfe2l1-KD细胞,收集其培养上清液处理黑色素瘤细胞,观察黑色素瘤细胞6 h、24 h、48 h时划痕愈合的变化。结果显示,与RAW 264.7 Scramble条件培养液处理组相比RAW 264.7 Nfe2l1-KD处理组划痕愈合能力更强。8.肿瘤细胞上清液可以促进巨噬细胞向M2亚型极化:为了探讨小鼠肺转移模型中Nfe2l1对巨噬细胞极化的调控作用,我们利用黑色素瘤细胞的上清模拟肿瘤微环境,分别作用于Nfe2l1（M）-KO与Nfe2l1-KI的BMDM,RT-q PCR结果显示Il10、Vegfα、Mmp9等M2型巨噬细胞标志物的m RNA表达水平升高,且差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.成功构建髓系细胞Nfe2l1特异性缺失小鼠模型。2.髓系细胞中Nfe2l1特异性缺失对肿瘤生长无明显影响,但可以促进肿瘤的转移。3.NFE2L1可能通过促进巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化,进而发挥促进肿瘤转移的作用。