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滋养细胞（trophoblast）是胎盘的主要细胞成分,与母体蜕膜一起,是构成母胎界面的主要细胞成分。它参与了胚胎的着床、胎盘的形成和发育、母胎界面的免疫调节和正常子宫-胎盘血流灌注的形成。当滋养细胞功能发生异常时,胎盘浅着床、免疫耐受失调、螺旋动脉重铸异常,将导致胚胎发育异常、着床能力受限、胎盘发育及功能异常、胎儿生长发育异常,导致如早期妊娠丢失、子痫前期、胎儿宫内生长受限等不良妊娠结局的发生。调控滋养细胞功能的基因众多,特别是胎盘特异性表达的基因,如PLAC1、syncytin。这些基因调控着滋养细胞的迁移、浸润、增殖、凋亡和代谢等功能。Galectin-14就是一个胎盘特异表达的基因。Galectin-14属于galectin家族。近年来,多项研究发现galectin家族成员,如galectin-1,3,9和13等,在多种妊娠相关疾病的胎盘中表达异常。其中,galectin-1和galectin-13在早期妊娠丢失和子痫前期中表达下调;而galectin-3和galectin-9在子痫前期中表达上调,提示它们可能参与母胎界面的调控。进一步的研究表明,galectin-1和galectin-3主要调控滋养细胞迁移和浸润;而galectin-9和galectin-13主要调节免疫细胞功能。Galectin-14是galectin家族成员,特异性表达于胎盘,目前被认为是灵长类动物所特有。近年来,研究发现galectin-14与子痫前期、早期妊娠丢失等妊娠相关疾病关系密切。进一步发现,galectin-14可能参与妊娠的建立与维持。但目前关于galectin-14如何调节滋养细胞功能的研究尚属空白。本研究中首先采用RT-q PCR、Western blot等方法比较galectin-14在重度子痫前期胎盘组织中与正常妊娠胎盘组织中的m RNA及蛋白水平上的表达差异。结果显示,在重度子痫前期胎盘中,galectin-14的蛋白表达量均明显下降,提示galectin-14可能参与了子痫前期的发生。通过使用原代滋养细胞和滋养细胞系,构建细胞内galectin-14表达调控模型,探究滋养细胞内galectin-14对细胞功能的影响。在发现galectin-14可以促进滋养细胞迁移、浸润后,进一步检测了在调控细胞内galectin-14表达后,主要参与影响滋养细胞迁移和浸润能力的重要分子标志物的表达水平（和活性）改变。结果发现galectin-14可促进滋养细胞表达细胞上皮-间质转化标志分子N-cadherin,和滋养细胞分泌的主要胞外基质降解酶MMP-9的蛋白表达水平及提高MMP-9活性。在此基础上,进一步发现,galectin-14通过激活MAPK/P38信号通路上调N-cadherin的表达,通过激活Akt信号通路上调MMP-9的表达并激活其活性。研究结果充实了关于galectin-14调控滋养细胞功能及相关分子机制的研究,对了解滋养细胞功能异常在子痫前期等妊娠相关疾病的发病中的作用提供了新思路。第一部分Galectin-14在重度子痫前期胎盘组织中的表达研究目的:探究galectin-14在重度子痫前期胎盘与正常胎盘组织间的表达差异。材料和方法:1.收集2017年-2019年在浙江大学医学院附属妇产科医院因重度子痫前期、因臀位行剖宫产术病例的胎盘组织,其中包括20例因重度子痫前期和20例因臀位行剖宫产手术的胎盘组织。2.提取上述两组胎盘组织的RNA和总蛋白,通过荧光定量PCR检测galectin-14的m RNA表达水平,通过蛋白质免疫印迹法检测galectin-14的蛋白水平。结果:1.与正常妊娠组胎盘组织相比,重度子痫前期组胎盘组织中galectin-14m RNA表达水平降低,但差异无统计学意义。2.与正常妊娠组胎盘组织相比,重度子痫前期组胎盘组织中galectin-14的蛋白表达水平显著降低。结论:Galectin-14在重度子痫前期胎盘中蛋白表达量低于正常组,提示galectin-14可能参与重度子痫前期等妊娠相关疾病的发病过程。第二部分Galectin-14在调节滋养细胞功能中的作用研究目的:建立滋养细胞的galectin-14基因表达调控模型,探究galectin-14对滋养细胞功能的影响。材料和方法:1.提取原代绒毛外滋养细胞、滋养细胞株HTR-8/SVneo、SWAN-71、JAR、JEG-3、Be Wo的RNA,通过RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳检测其中galectin-14的m RNA表达情况。2.根据上述检测结果,分别在原代滋养细胞和滋养细胞株HTR-8/SVneo中,通过小干扰RNA转染构建galectin-14表达敲减模型,通过慢病毒质粒转染构建过表达模型。3.在调控滋养细胞中galectin-14表达水平后,通过cck-8检测滋养细胞增殖的改变,通过流式细胞术检测凋亡情况的改变,通过transwell迁移和浸润分析检测细胞迁移、浸润功能的改变。结果:1.在原代绒毛外滋养细胞中可以检测到galectin-14 m RNA表达,但在滋养细胞株HTR-8/SVneo、SWAN-71、JAR、JEG-3、Be Wo中未能检测到galectin-14 m RNA表达。2.完成在原代绒毛外滋养细胞中galectin-14的敲减和在HTR-8/SVneo中的过表达,敲减和过表达效率经荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹和细胞免疫荧光检测验证。3.在敲减或过表达galectin-14的滋养细胞中,通过RT-qPCR检测其他滋养细胞表达的galectin家族成员的表达水平变化,验证敲减和过表达的特异性。4.在原代绒毛外滋养细胞中敲减galectin-14后,细胞增殖和凋亡水平未发生显著改变,而细胞迁移、浸润能力显著降低。在HTR-8/SVneo中过表达galectin-14后,细胞增殖和凋亡水平未发生显著改变,而细胞迁移、浸润能力显著提高。结论:Galectin-14表达于原代绒毛外滋养细胞。在滋养细胞中,galectin-14促进细胞迁移、浸润能力,而不影响细胞增殖能力和凋亡水平。第三部分Galectin-14参与调控滋养细胞迁移、浸润能力的机制研究研究目的:研究galectin-14对影响滋养细胞迁移、浸润能力的主要生理过程的影响,及对相关信号分子通路的影响。材料和方法:1.调控galectin-14表达后,通过Western blot检测滋养细胞中主要影响细胞迁移、浸润能力的上皮-间质转化相关分子标志N-cadherin、E-cadherin、VE-cadherin,以及滋养细胞分泌的明胶酶MMP-2、MMP-9和对应组织抑制物TIMP-2、TIMP-1的表达水平,通过明胶酶谱法检测MMP-2、MMP-9的活性;2.根据上述实验结果,在滋养细胞中,通过si RNA敲减基因表达等技术,验证表达水平受galectin-14调控影响的相关分子对滋养细胞迁移、浸润能力的影响。3.根据上述实验结果,选择与受调控分子表达相关的信号通路,检测信号通路中主要调节因子磷酸化水平及表达水平,筛选出参与galectin-14调节滋养细胞迁移、浸润能力的信号通路。4.通过使用激动剂和抑制剂,检测调节相关信号通路后,对滋养细胞迁移、浸润功能的影响,及相应的下游作用分子的表达水平改变。结果:1.在原代绒毛外滋养细胞中敲减galectin-14后,N-cadherin、MMP-9表达水平显著下降,MMP-9活性显著降低,而VE-cadherin、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2表达水平无显著差异,MMP-2活性无显著改变;在过表达galectin-14的HTR-8/SVneo中,相较于空载体组,N-cadherin、MMP-9表达水平显著升高,MMP-9活性显著增高,而VE-cadherin、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2表达水平无显著差异,MMP-2活性无显著改变。在原代绒毛外滋养细胞和滋养细胞株HTR-8/SVneo中未检测到E-cadherin表达。2.在过表达galectin-14的HTR-8/SVneo中,敲减N-cadherin表达后,细胞迁移和浸润均显著受到抑制,而敲减未能对滋养细胞增殖能力产生显著改变;敲减MMP-9表达后,细胞迁移和浸润均显著受到抑制,细胞增殖能力未发生显著改变。3.在与调控N-cadherin、MMP-9表达相关的MAPK/P38、ERK、SMAD2/SMAD3、Akt信号通路中,在原代绒毛外滋养细胞中敲减galectin-14后,pAkt、p-P38表达水平显著下降,p-Akt/Akt、p-P38/P38显著降低,而p-ERK、p-SMAD2、p-SMAD3表达水平无显著差异,p-ERK/ERK、p-SMAD2/SMAD2、pSMAD3/SMAD3无显著改变;在过表达galectin-14的HTR-8/SVneo中,相较于空载体组,p-Akt、p-P38表达水平显著增加,p-Akt/Akt、p-P38/P38显著升高,而p-ERK、p-SMAD2、p-SMAD3表达水平无显著差异,p-ERK/ERK、p-SMAD2/SMAD2、pSMAD3/SMAD3无显著改变。4.在过表达galectin-14的HTR-8/SVneo中,使用Akt信号通路激动剂SC79后,p-Akt表达水平、p-Akt/Akt显著升高,即使细胞增殖受到显著抑制,细胞迁移、浸润能力显著提高,MMP-9表达水平及活性均显著升高,而N-cadherin表达水平无显著改变;使用Akt信号通路抑制剂LY294002后,p-Akt表达水平、p-Akt/Akt显著下降,细胞增殖无明显改变,细胞迁移、浸润能力显著降低,MMP-9表达水平及活性均显著下降,而N-cadherin表达水平无显著改变。5.在过表达galectin-14的HTR-8/SVneo中,使用P38信号通路抑制剂SB202190后,p-P38表达水平、p-P38/P38显著下降,细胞增殖无显著改变,细胞迁移、浸润能力显著降低,MMP-9表达水平无明显改变,而N-cadherin表达水平显著减少。结论:Galectin-14可以促进滋养细胞表达MMP-9和N-cadherin,激活MMP-9活性。而滋养细胞中MMP-9和N-cadherin表达水平增高,MMP-9活性增加,可以促进细胞的迁移和浸润。Galectin-14通过激活Akt信号通路促进滋养细胞表达MMP-9,激活MMP-9活性;通过激活MAPK/P38信号通路促进滋养细胞表达N-cadherin。