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肿瘤转移是涉及到肿瘤细胞行为及靶组织特异性等多因素、多步骤的级联反应。外泌体作为细胞间通讯的介质,携带核酸、蛋白和脂类等活性成分,参与肿瘤转移级联反应的各个阶段。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）被报道广泛存在于外泌体中,发挥着复杂的基因调控功能,是近年来的研究热点。卵巢癌仍是致死率最高的妇科恶性肿瘤,腹腔的广泛转移是造成晚期卵巢癌患者预后差的主要原因之一。在腹腔环境中,腹膜间皮细胞组成的间皮层是阻止细菌和肿瘤侵袭的第一道屏障,间皮细胞在肿瘤转移时可发生间皮-间充质转变（mesothelial-mesenchymal transition,MMT）以利于肿瘤腹膜定植,然而其具体机制尚不明确。深入探究外泌体lncRNA在重塑腹膜间皮细胞及卵巢癌腹腔转移中的作用对于寻找新的靶向治疗方法至关重要。本研究首先分离及鉴定卵巢癌细胞上清及卵巢癌腹水的外泌体,并将提取的外泌体与腹膜间皮细胞共培养,通过细胞形态、Western blot实验和Transwell迁移实验观察间皮细胞发生MMT转化,通过粘附实验检测卵巢癌细胞对间皮细胞的粘附能力改变。通过lncRNA测序和qRT-PCR验证卵巢癌外泌体介导间皮细胞MMT过程的关键lncRNA SPOCD1-AS,通过基因调控、小鼠卵巢原位移植瘤模型等手段明确SPOCD1-AS促进间皮细胞MMT转变的作用,并证实SPOCD1-AS可由卵巢癌外泌体包裹并传递至间皮细胞调控其表型,从而促进卵巢癌的腹腔转移。进一步通过RNA pull-down、RNA免疫共沉淀等多种手段明确SPOCD1-AS通过结合G3BP1蛋白介导间皮细胞MMT过程。此外,本研究验证了 G3BP1的F380/F382两个苯丙氨酸残基是SPOCD1-AS与G3BP1结合的关键位点,并基于此构建了阻断其结合的抑制性短肽。抑制性短肽可有效抑制间皮细胞的MMT转化,并在小鼠原位模型中显著减少卵巢癌的腹腔转移。本研究旨在阐明卵巢癌外泌体lncRNA在卵巢癌腹腔转移中的新机制,为寻找卵巢癌治疗新靶点提供新思路。第一部分 卵巢癌来源外泌体介导腹膜间皮细胞MMT转化目的:证实卵巢癌来源外泌体介导腹膜间皮细胞MMT转化,促进卵巢癌细胞对间皮细胞的粘附。方法:首先通过超速离心法提取卵巢癌细胞系（SKOV3,A2780）和永生化卵巢上皮细胞（IOSE-80）外泌体,透射电镜、粒径分析和Western blot检测外泌体表面蛋白标记物对提取的外泌体进行鉴定,通过外泌体摄取实验观察间皮细胞（MeT-5A）摄取外泌体的情况。将上述外泌体与间皮细胞共培养,通过细胞形态、Western blot实验、Transwell迁移实验和粘附实验观察间皮细胞MMT转化及卵巢癌对间皮细胞粘附能力的改变。另外收取2例卵巢良性肿瘤腹腔液和3例卵巢癌腹水,通过试剂盒沉淀法提取外泌体后同样作用于MeT-5A细胞,观察卵巢癌腹水外泌体对间皮细胞MMT的作用。结果:1.卵巢癌细胞上清及卵巢癌腹水中可以分离出典型的外泌体结构。2.与空白对照和永生化卵巢上皮细胞外泌体相比,卵巢癌细胞外泌体可促进间皮细胞的MMT转化,并增强卵巢癌细胞对间皮细胞的粘附能力。3.与空白对照和良性肿瘤腹腔液外泌体相比,卵巢癌腹水来源的外泌体亦可促进间皮细胞的MMT转化,并增强卵巢癌细胞对间皮细胞的粘附能力。结论:卵巢癌来源的外泌体可介导间皮细胞发生MM T转化,以促进卵巢癌粘附。第二部分 卵巢癌外泌体通过传递SPOCD1-AS介导间皮细胞MMT转化目的:明确卵巢癌外泌体通过传递SPOCD1-AS介导间皮细胞MMT转化,以促进卵巢癌粘附及腹腔转移。方法:首先通过lncRNA测序及qRT-PCR验证卵巢癌外泌体介导间皮细胞MMT转化过程中关键的lncRNA分子SPOCD1-AS,通过RACE实验、Northern blot实验明确其全长,软件分析其编码蛋白能力,通过qRT-PCR验证SPOCD1-AS在卵巢癌及其外泌体中表达情况;再通过FISH及核质分离明确SPOCD1-AS胞内定位,应用过表达慢病毒及shRNA分别上、下调SPOCD1-AS表达验证其在诱导间皮细胞MMT转化中的作用;另外在卵巢癌细胞系A2780中稳定敲低SPOCD1-AS,在永生化卵巢上皮细胞IOSE-80中稳定过表达SPOCD1-AS后分别提取低、高表达SPOCD1-AS的外泌体,作用于间皮细胞,观察外泌体传递SPOCD1-AS介导间皮细胞的MMT转化;最后建立小鼠卵巢原位移植瘤模型,成瘤后腹腔注射低、高表达SPOCD1-AS的外泌体及外泌体分泌抑制剂GW4869,在体内观察卵巢癌外泌体及外泌体SPOCD1-AS对卵巢癌腹腔转移的作用。结果:1.SPOCD1-AS在卵巢癌细胞来源外泌体处理的间皮细胞中显著上调。与IOSE-80细胞相比,SPOCD1-AS在卵巢癌细胞系中高表达;与IOSE-80外泌体相比,SPOCD1-AS在卵巢癌细胞外泌体中也高表达。2.SPOCD1-AS可促使间皮细胞发生MMT转变。3.SPOCD1-AS敲低的卵巢癌细胞来源外泌体不具有介导间皮细胞MMT转化的功能,而SPOCD1-AS过表达的永生化卵巢上皮细胞来源外泌体具有介导间皮细胞MMT转化的功能。4.体内实验显示外泌体SPOCD1-AS可促进卵巢癌的腹腔转移,而抑制外泌体分泌可显著减少卵巢癌腹腔转移。结论:1.SPOCD1-AS具有促进腹膜间皮发生MMT转化的功能。2.卵巢癌细胞通过分泌的外泌体传递SPOCD1-AS介导间皮细胞发生MMT转化,以促进卵巢癌的腹腔转移。第三部分 SPOCD1-AS通过结合G3BP1蛋白介导间皮细胞MMT转化目的:揭示SPOCD1-AS促进间皮细胞MMT转化的分子机制。方法:首先通过RNApull-down实验、质谱分析及Western blot鉴定并验证与SPOCD1-AS结合的G3BP1蛋白,通过RIP实验反向验证G3BP1与SPOCD1-AS的结合关系,FISH免疫荧光分析SPOCD1-AS与G3BP1蛋白在胞内的共定位情况;接着采用siRNA下调间皮细胞中G3BP1表达,验证G3BP1在间皮细胞MMT转化中的作用,在干扰G3BP1的同时过表达SPOCD1-AS,进一步明确SPOCD1-AS通过G3BP1介导间皮细胞MMT转化;最后通过构建并转染结合域截短质粒及点突变质粒明确SPOCD1-AS与G3BP1结合位点,并针对结合位点设计合成阻断SPOCD1-AS/G3BP1结合的抑制性短肽,通过体内外实验验证抑制性短肽抑制间皮细胞MMT转化及减少卵巢癌腹腔转移的作用。结果:1.SPOCD1-AS与G3BP1蛋白存在结合关系。2.敲降G3BP1可抑制间皮细胞的MMT转化,并减少卵巢癌细胞的粘附。3.共转染实验显示SPOCD1-AS通过G3BP1介导间皮细胞的MMT转化。4.截去RRM结构域及F380L/F382L突变的G3BP1与SPOCD1-AS的结合显著减少。5.针对F380/F382位点的G3BP1抑制性短肽可穿过细胞膜进入细胞,竞争性结合SPOCD1-AS从而阻断细胞内SPOCD1-AS与G3BP1的结合。6.G3BP1抑制性短肽在体外试验中可抑制间皮细胞的MMT转化,减少卵巢癌细胞的粘附;在体内实验中显著减少卵巢癌的腹腔转移。结论:1.SPOCD1-AS通过结合G3BP1介导间皮细胞发生MMT转化,促进卵巢癌细胞粘附。2.F380/F382是SPOCD1-AS结合G3BP1的关键位点,G3BP1抑制性短肽可特异性阻断SPOCD1-AS与G3BP1的结合,从而抑制间皮细胞MMT转变及卵巢癌腹腔转移。