研究背景脑卒中在全世界范围内具有极高的发病率,危害性大,导致患者的残疾甚至死亡,其发病机制复杂,造成神经细胞的死亡,导致脑损伤。患者的恢复情况取决于缺血时间,病灶的位置及大小和缺血诱发的内源性保护程度。血流灌注减少后,氧和糖的供应均出现不足,可导致脑细胞损伤,引起过氧化、离子失衡、炎性反应、神经毒性和凋亡等多个病理过程,从而致使脑细胞死亡。氧或糖的供需失代偿是导致脑缺血损伤的重要因素,目前临床上最有效的治疗方式是快速恢复脑组织血供,在时间窗内开通血管,最大程度上减少脑细胞的死亡,包括静脉溶栓及血管内治疗等;从另一角度考虑,增加脑细胞在缺血早期的生存能力,也可以达到相同目的,这就是神经保护的范畴,但具体机制尚不完全清楚。为了探明其保护机制,我们对查阅文献,对其中可能的信号通路进行了—系列的研究。当脑组织发生缺血时,细胞中活性氧的数量增多。活性氧的过量生成或是代谢减少,可以调节多条信号通路,并激活多种促炎因子的表达。同时,脑细胞可相应的增加有益因子的产生,以减少缺血导致的损伤。在缺血后神经保护领域,Sonic hedgehog信号通路的研究已有报道。Shh属于脊椎动物三种hedgehog同源基因中的一种,其在同源基因中特征最明显、分布最广泛,在胚胎的正常发育中起重要作用。Shh同其受体Patched（Ptch1）结合,导致 Smoothened（Smo）去抑制,激活 Gli2,Gli1 在 Sufu 合成体上解脱并入核,启动转录,进一步调控该通路下游多种因子的表达,参与细胞的增殖及组织的分化。Shh的拮抗剂及抑制剂在过程中发挥了重要作用,与Smo结合的Shh信号拮抗剂包括cyclopamine、SANT1和Cur-61414,激动剂包括合成的小分子purmorphamine和SAG。近期研究表明,Shh通路在许多神经系统疾病中被激活,并且已有研究证明,该通路在神经损伤中的发挥重要作用。据报道,卒中后Shh在多种细胞类型中表达上调,通过Shh激动剂治疗可改善亚急性期的功能。Shh具有促血管生成、抗氧化和抗凋亡作用,可以改善缺血后脑细胞的功能。Shh信号通路作为调节因子,在脑损伤后特别是缺血后的自我更新和功能恢复中发挥重要作用。Shh通路的激活可以通过信号调控下游靶基因ROS和神经元凋亡来发挥神经保护功能,但其调控机制尚不完全清楚。在我们的研究中,主要探讨氧糖剥夺（Oxygen-glucose Deprivation）损伤早期Shh信号通路在小鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（PC12）细胞和原代小鼠皮质神经元中的作用及其分子机制,以及在大脑中动脉闭塞（Middle cerebral artery occlusion）大鼠模型中,Shh信号通路对缺血损伤后神经功能的保护机制。研究目的1.制作小鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞及原代皮层神经元缺糖缺氧模型,观察缺氧缺糖对Shh,Gli-1,Ptch表达的影响。使用Shh激动剂Purmorphamine（PUR）处理两种细胞,观察其对Gli1转移的作用及Cyc预处理对Shh表达的影响。2.制作小鼠原代皮层神经元缺糖缺氧模型,PUR处理后观察其对缺氧缺糖诱导的细胞凋亡和ROS水平的影响;观察其对缺氧缺糖诱导的神经连接蛋白和轴突蛋白,CREB和BDNF表达、及AKT、NF-κB信号通路的影响。3.制作大鼠大脑中动脉闭塞模型（MACO）,观察PUR干预对大鼠损伤后神经功能恢复的影响。研究方法1.制作原代神经元缺糖缺氧模型应用PND1小鼠获得皮质神经元,细胞在poly-D-lysine包被的培养板中培养7天。细胞在37℃、95%N2和5%CO2的条件下,在无葡萄糖的培养基中培养6小时。缺糖缺氧后,将原代神经元置于含PUR（20 μM）的神经基础培养基中,培养基含或不含Cyc（10μM）,在相应时间点进行干预处理。2.PC12细胞缺糖缺氧模型的制备将PC12细胞接种于无血清培养基的12孔板中,按指定时间用转染和未转染的间充质干细胞的外泌体（100μg/mL）处理。将PC12细胞暴露于缺氧缺糖条件下6小时,然后将PC12细胞置于含或不含PUR（20 μM）、含或不含Cyc（10 μM）的原始培养基中,在相应时间点进行干预处理,可模拟体外缺血情况。3.大脑中动脉闭塞模型的制备（MCAO）根据以往研究制作大鼠大脑中动脉闭塞模型,使局灶性脑梗死发生在大脑中动脉（MCA）区域的右外侧大脑皮层。异氟烷麻醉大鼠后,将大鼠用胶带固定于操作台上,颈部剃毛并消毒,眼科剪在皮肤上剪出长度约为5cm的纵向切口,切口延锁骨正中线,血管钳钝性分离皮下结缔组织,逐层逐步暴露颈总动脉,用小动脉夹阻断颈总动脉及颈内动脉血流,在距分叉处约5mm的颈外动脉上用5-0缝合线结扎,在远端离断,用眼科剪在距分叉处约3mm的颈外动脉血管外壁上做一小型切口,用血管镊将线栓由此切口缓慢送入颈内动脉,推进时缓慢松开颈内动脉动脉夹,至线栓不能继续前行时表明已到达大脑中动脉。插入完毕后,在切口近端结扎颈外动脉,松开颈总动脉动脉夹。使用酒精棉球消毒后逐层缝合。假手术组给予同样手术操作,包括对颈外动脉做切口和结扎,但不插入线栓。MCAO模型建成后48小时进行大鼠的神经功能评分,并取脑组织进行后续检测。4.流式细胞术检测细胞凋亡采用Annexin V-FITC/PI双标记凋亡检测试剂法和流式细胞仪分别检测PC12细胞的凋亡情况和凋亡水平。其中每组样品都上样3次,每组重复3次。5.Tunel 染色使用末端脱氧核苷转移酶介导的Tunel染色,在上述各组的病灶范围内,随机选取6个200倍放大的显微镜视野测量Tunel阳性细胞的数量（N=4鼠/组）,以评估原代细胞凋亡。6.ROS活性氧检测利用DHE活性氧检测试剂盒,神经元细胞用10 μM DHE染色30分钟,冲洗固定后,在荧光显微镜下捕捉荧光图像,来检测ROS活性氧的产生。DHE染色结果使用Image-pro plus图像分析系统进行像素化和量化分析。7.免疫蛋白印迹将剥离的小鼠脑组织加入PMSF和蛋白酶/磷酸酶抑制剂的RIPA进行裂解,4℃、13800 × g离心10分钟。在蛋白上清中加入5×上样缓冲液,使用BCA检测试剂盒CWBIO对总蛋白进行定量。取等量的蛋白用SDS-PAGE胶分离后,换至PVDF膜上。随后在5%脱脂牛奶中静置1小时。孵育Shh,Gli-1,Patch,p-CREB,CREB,BDNF,p-Akt,Akt,NF-1κB,p-NF-κB,β-actin 蛋白的一抗,4℃过夜后使用PBST清洗4遍,二抗室温孵育60 min,PBST清洗4遍后,使用Tanon成像系统（Tanon-4600）和ECL试剂盒检测化学发光信号,在Image J系统上完成蛋白条带密度的半定量分析。8.荧光实时定量PCR将Trizol试剂加入脑组织中,提取总RNA,应用ExoQuick-TCTM分离EVs后,使用血清Mir EVs RNA试剂盒完成EVs和H2S-EVs总RNA的提取,利用逆转录系统合成互补DNA（cDNA）,按照试剂盒说明操作。利用实时荧光定量PCR技术检测相应因子mRNA的生成,以及缺氧缺糖处理后的表达变化。9.细胞组织化学检测免疫荧光染色,细胞用一抗（Gli-1,1:100）孵育,4℃过夜。次日,加入二抗,在37℃孵育玻片中放置30分钟,用DAPI对细胞核染色,3分钟后放在荧光显微镜下观察。利用免疫荧光染色技术检测Gli-1的入核情况,使用Image-Pro Plus 6.0软件进行图像分析。10.统计学分析以均数±标准差表示结果。应用Prism 6.0软件,采用One-way ANOVAs及Tukey’s post hoc 比较方法进行统计分析。P<0.05为差异有显著性意义。研究结果1.与对照组相比,Shh在OGD损伤后的4小时和8小时表达较高,在1小时和24小时表达降低。OGD损伤后在24小时Gli-1和Ptch的表达下调。PUR处理可促进Gli-1核易位。Cyc预处理阻断了 PUR对OGD暴露后Shh表达的影响。2.与对照组相比,OGD损伤后凋亡细胞明显增多。PUR处理显著降低了Tunel阳性细胞的比例。Cyc预处理阻断了 PUR对凋亡细胞数量的影响。3.与对照组相比,OGD损伤后24小时,ROS生成显著增加,PUR处理降低了 OGD诱导的ROS的增加。Cyc可阻断了 PUR对ROS生成的影响。4.神经连接蛋白和轴突蛋白的表达在OGD损伤后8小时和24小时降低。PUR处理使两种蛋白的表达增加。Cyc阻断了 PUR对神经连接蛋白和轴突蛋白表达的影响。5.p-CREB和BDNF的表达在OGD损伤后4小时显著降低。PUR处理后p-CREB和BDNF的表达增加。Cyc阻断了 PUR对p-CREB和BDNF的影响。6.与对照组相比,p-Akt在OGD损伤后4小时表达降低,p-NF-κB表达增加。PUR的干预可加强Akt信号通路的表达,抑制p-NF-κB的表达。7.PUR处理可改善MCAO大鼠损伤后的神经功能,减少细胞凋亡。结论1.OGD后,Shh、Ptch和Gli-1的表达下调,细胞凋亡增加,活性氧生成增加。2.OGD后,突触蛋白（包括神经连接蛋白和轴突蛋白）的表达下调。3.Shh激动剂PUR预处理后可增加神经元细胞核中Gli-1的表达,保护OGD诱导的神经元损伤,而Shh抑制剂环巴胺作用则相反。4.PUR激活OGD抑制的Shh信号通路,促进CREB磷酸化,上调BDNF、神经连接蛋白和轴突蛋白的表达。5.PUR激活OGD抑制的Shh信号通路,上调Akt,抑制NF-κB。以上结果表明,Shh信号激活后,通过上调Akt并抑制NF-κB信号通路,减少OGD诱导的突触损伤和细胞凋亡。