链霉菌是微生物中产抗生素种类最多的种属,目前世界上发现的5000多种抗生素中,60%以上是由链霉菌合成的。作为抗生素的生产菌,链霉菌在传统发酵工业中有着悠久的历史,随着分子遗传学的发展,链霉菌的基因重组展现了广阔的应用前景。自1980年首次报导链霉菌基因克隆以来,链霉菌基因工程日益兴起。载体作为基因工程的重要工具是链霉菌基因工程首先遇到的问题。最初科学家们根据对少数几种链霉菌遗传背景已有的认识,建立了一系列由其质粒和噬菌体衍生的克隆型载体。后来为了研究某些链霉菌基因的功能,需将其基因克隆至大肠杆菌中表达或修饰,有的甚至还需再转移到模式链霉菌株(如天蓝色链霉菌和变铅青链霉菌)中做进一步研究,于是各个实验室纷纷开始构建大肠杆菌-链霉菌穿梭型载体。随着链霉菌遗传工程的进一步发展,其对载体的要求越来越高,各种功能不同的载体相继诞生,如链霉菌粘粒载体、链霉菌基因定域置换型克隆载体等。与此同时链霉菌转化系统也开始建立,主要有PEG介导或脂质体协助的原生质体转化法,以及电击转化法等。但由于链霉菌特殊的结构特点,使得这些转化方法在实际应用中遇到不少障碍,效率比较低。1987年,Trien-Cuot等首次阐明大肠杆菌与许多革兰氏阳性细菌之间可进行质粒的接合转移的现象,在此基础上,Mazodier发展了质粒在大肠杆菌和链霉菌之间进行接合转移的方法,即向大肠杆菌-链霉菌穿梭载体上引入接合转移顺式作用元件oriT,将其转化到携带RP4质粒的大肠杆菌中,载体就在RP4上的反式作用元件tra的诱导下由大肠杆菌接合转移到链霉菌中去,这种方法不但易于操作,而且可避开链霉菌的甲基化限制作用,提高外源基因的存活率。已有报导,重组质粒在链霉菌中不能稳定性存在,即使是通过接合转移转化的也不例外。人们就尝试构建一种可整合至链霉菌基因组的载体,主要由Streptomyces ambofaciens的质粒pSAM2改造和链霉菌噬菌体φC31衍生得到。其中噬菌体φC31的衍生载体因有较高的转化效率而颇受偏爱,如pSET152就是由其整合系统衍生而来,即在载体上引入attP序列(phage attachment site)和整合酶基因(int),整合酶可介导attP与链霉菌基因组内的attB (bacterial attachment site)间位点特异性重组,从而将整个载体包括外源基因整合进链霉菌基因组中,使外源基因在没有选择压力的情况下在链霉菌中稳定存在。以上问题解决后,链霉菌的基因工程一直平稳进行着,但随着研究的深入新的难题不断涌现。链霉菌基因组测序完成后人们发现,在链霉菌基因组中与某一天然产物生物合成途径相关的基因往往成簇存在,因此都比较大(>60kb),要想完整地克隆这些基因簇就必须要有能装载大片段的载体。目前应用较广的大片段克隆载体有酵母人工染色体(YAC)和细菌人工染色体(BAC), BAC的插入片段不如YAC长,但其有很多优点可弥补YAC的不足,这就使得其应用和发展远远超过了YAC。现有的BAC载体多以大肠杆菌为宿主,缺乏在链霉菌中进行基因操作的元件,使得其在链霉菌基因工程中的应用受到很大限制。本实验从原始载体pBeloBAC11出发,将其上的氯霉素抗性基因替换为用于接合转移(oriT)、定点整合(attp-int)和安普霉素抗性筛选(Am)的oriT-attp-int-Am的DNA片段(称之为替换盒),为了精确替换,实验采用了Red同源重组的方法,即将一段两端与染色体(或载体)特定靶序列两翼各有40-60bp同源序列的PCR线性DNA片段导入宿主菌细胞,利用λ噬菌体Red重组酶使该线性片段与靶序列发生同源重组,线性DNA片段即可替换靶序列,得到的质粒命名为pBTIBAC1。其中Red重组酶由辅助质粒pKD46携带,其表达受L-阿拉伯糖诱导,且具有温度敏感型的复制子,在温度高于37℃时,自动从宿主菌中清除。为便于以后使用,合成新的多克隆位点(MCS),其上包含EcoR Ⅰ、Avr Ⅱ、 Pac Ⅰ、Pme Ⅰ、Swa Ⅰ、BamH Ⅰ酶切位点,通过EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切插入到pBTIBAC1的相应位点,得到最终载体pBTIBAC11。接下来是对pBTIBAC11功能的验证。先检验其是否具有接合转移和整合的功能,在其多克隆位点反向插入链霉菌的组成型启动子ermEp*和绿色荧光蛋白基因(gfp),得到重组质粒转化ET12567(pUZ8002)(接合转移供体菌),再通过接合转移转至变铅青链霉菌中,通过多标记微孔板检测仪(酶标仪)和激光扫描共聚焦显微镜观察,结果都显示了绿色荧光蛋白的表达,说明载体pBTIBAC11具有预期接合转移和整合的功能。然后检测其装载量。为了获得足够大的插入片段,采用了构建基因组文库的方法,将变铅青链霉菌TK24(Streptomyces lividans TK24)的基因组做BamH Ⅰ的部分酶切,然后进行脉冲场凝胶电泳,切取48.5-194.0kb的胶条进行第二次脉冲场凝胶电泳,电洗脱回收条带较亮部分,连入pBTIBAC11的相应位点,电转至DH10B中,对通过安普抗性筛选得到的转化子克隆提质粒,用EcoR Ⅰ和BamHⅠ短暂酶切鉴定插入片段的大小,平均都在100kb左右。综上,本实验从原始载体pBeloBAC11出发：①引入oriT序列,方便其由大肠杆菌接合转移至链霉菌中,克服了链霉菌难于转化和链霉菌严格限制系统的问题；②加入attp-int元件,可使外源基因(簇)连同载体一起整合至链霉菌基因组中,提高了外源基因(簇)的稳定性；③替换了氯霉素抗性为安普霉素抗性,可用于载体转化大肠杆菌和链霉菌的特异性筛选标记；④保留了BAC载体原有的功能元件,为大片段基因簇在链霉菌中的异源表达奠定了基础；⑤保留了LacZa,可使用蓝白斑筛选重组克隆；⑥没有添加启动子,可根据需要添加组成型或诱导型的启动子。故该载体可用于链霉菌基因文库的构建,并由接合转移转化至链霉菌中,通过改造宿主菌遗传背景或设置特定的培养条件从而筛选有功能的未知基因簇,亦可将已知基因簇转化至链霉菌中异源表达,通过改变发酵和培养条件提高产量或效能。