【摘 要】
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[目的]本研究旨在探讨KLK14在宣威女性肺腺癌组织中的表达,验证其对肺腺癌细胞生物学功能的影响,预测其在肺腺癌中发挥生物学功能的可能机制。[方法]1、本研究收集经手术切除的宣威非吸烟女性肺腺癌病人肿瘤组织和配对正常肺组织35对,并利用免疫组化技术检测KLK14蛋白水平的表达,比较两组间蛋白表达差异。2、采用Western Blot技术检测并比较人肺腺癌细胞系A549、XWLC-05、H1299、
【基金项目】
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国家自然科学基金资助项目（81860325），医用生物材料表面细菌与真菌混合生物膜中持留菌的形成及其持留机制研究； 云南省教育厅科学研究基金资助项目（2022J0262），KLK14基因水平改变对宣威肺癌细胞生物学功能的影响；
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[目的]本研究旨在探讨KLK14在宣威女性肺腺癌组织中的表达,验证其对肺腺癌细胞生物学功能的影响,预测其在肺腺癌中发挥生物学功能的可能机制。[方法]1、本研究收集经手术切除的宣威非吸烟女性肺腺癌病人肿瘤组织和配对正常肺组织35对,并利用免疫组化技术检测KLK14蛋白水平的表达,比较两组间蛋白表达差异。2、采用Western Blot技术检测并比较人肺腺癌细胞系A549、XWLC-05、H1299、H1734、H838、H1650、H1975、H2126、H23 和 H358 中 KLK14 蛋白表达水平,根据KLK14蛋白表达情况选取合适的两株细胞作为工具细胞。3、利用CRISPR/Cas9技术构建KLK14基因敲除细胞株,并通过慢病毒转染构建KLK14稳定过表达细胞株。4、采用CCK-8实验、Transwell侵袭和迁移实验、划痕实验、流式细胞学技术在细胞水平研究KLK14对肺腺癌细胞增殖能力、侵袭能力、迁移能力、细胞周期及凋亡的影响。5、对KLK14过表达细胞株进行转录组测序,筛选差异表达基因进行GO富集分析及KEGG信号通路富集分析,预测KLK14发挥生物学功能的可能机制。[结果]1、KLK14在宣威女性肺腺癌组织中的阳性率为31.4%（9/35）,在配对正常肺组织中的阳性率为5.7%（2/35）,差异具有统计学意义（P＜0.05）。进一步的KLK14蛋白表达细胞定位显示KLK14蛋白弥漫性分布于宣威女性肺腺癌细胞的胞质和核周围区域。2、KLK14在肺腺癌细胞系中均有不同程度的表达,在H1299细胞中的表达水平最高,在A549细胞中的表达水平最低。3、设计的三条sgRNA均与载体质粒连接成功,CRISPR-Cas9敲除载体及KLK14过表达载体均通过慢病毒成功转染H1299细胞和A549细胞,Weastern blot检测KLK14蛋白水平的表达,H1299和A549敲除组KLK14表达水平均低于对照组,H1299和A549过表达组KLK14表达水平均低于对照组,KLK14基因敲除及过表达细胞株构建成功。4、KLK14过表达组较对照组细胞增殖能力明显增强（P＜0.05）;KLK14敲除组较对照组细胞增殖能力明显减弱;KLK14过表达组及敲除组较对照组细胞侵袭能力无明显变化（P＞0.05）;KLK14过表达组及敲除组较对照组细胞横向及纵向迁移能力均无明显变化（（P＞0.05））;KLK14过表达组较对照组细胞S期比例增加,G1/G0期比例减少,KLK14敲除组较对照组细胞G1/G0期比例增加S期比例减少（P＜0.05）;KLK14过表达组较对照组早凋及晚凋细胞比例减少,KLK14敲除组较对照组早凋及晚凋细胞比例增多（P＜0.05）。5、通过转录组测序筛选得到1186个差异表达基因,GO富集分析结果显示,差异表达基因主要富集在循环系统过程、花生四烯酸分泌、调节趋化作用、免疫反应的负调控等与肿瘤微环境相关的生物学过程。KEGG通路富集分析结果显示,差异表达基因显著富集在神经活性配体-受体信号通路和钙信号通路。[结论]KLK14在宣威非吸烟女性肺腺癌组织中异常表达,能够促进肺腺癌细胞增殖和进入分裂期,并抑制其凋亡;KLK14可能通过神经活性受体-配体信号通路和钙信号通路参与肿瘤微环境的调控,是其影响肺腺癌细胞恶性生物学行为的可能机制。
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